Osteoporosis is a skeletal disease with a strong aging-related prevalence. It is defined by low bone mass and compromised bone strength, leading to increased risk of fractures. Osteoporosis results from an imbalance in the bone remodeling process with aging in which more bone is being resorbed than being formed. The process of bone remodeling is thought to be controlled by osteocytes that steer the activity of osteoblast, the bone forming cells, and of osteoclasts, the bone resorbing cells. Osteocytes reside in cavities within the bone matrix called lacunae and interconnect through cell extensions that reside in small canals named canaliculi. Through this extensive communication network, the osteocytes sense mechanical loads upon bone. Osteocytes are able to modify their own microenvironment by removal and addition of bone at the surface of the lacunae. It has been shown that lacunae undergo morphological alterations with aging and bone pathologies. Whether these alterations affect the transmission of mechanical signals to osteocytes is not known, but if they would, than the disturbance in the regulation of bone remodeling such as seen with aging may reflect an impaired ability of the osteocytes to sense and/or respond to mechanical stimuli. In order to elucidate this potential pathway, the central hypothesis of this thesis was that changes in the osteocyte lacunar morphology would lead to changes in the mechanical conditions experienced by the osteocyte, which in turn would give rise to a modified response to mechanical loading. To test this hypothesis, four aims were defined:​ (i) to quantify the morphology of individual osteocyte lacunae, (ii) to quantify age-related changes in the osteocyte lacunar morphology, (iii) to relate the local bone mechanical strain to the osteocyte lacunar morphology, and (iv) to relate the osteocyte lacunar morphology to bone mechano-biological response.

In order to reach those aims, we developed a method for three-dimensional (3D) imaging, segmentation and quantification of the osteocyte lacunar network in murine bone using high-resolution desktop microcomputed tomography (µCT). We further evaluated the accuracy and reproducibility of μCT-derived cortical bone microstructural parameters. We concluded that desktop μCT is a valuable tool to quantify the 3D characteristics of bone vascular canals as well as lacunae which can be applied to intact murine bones with high accuracy and reproducibility. Using this 3D imaging method, we investigated potential age-related variations in the 3D morphology of the osteocyte lacunar network in fibulae of young and old mice. We found that osteocyte lacunae are becoming smaller and more spherical with aging. Since variations in the size and shape of the lacunae may cause changes in the local mechanical environment of the osteocytes, this observation led us to hypothesize that the lacunae with a large volume and low sphericity, as found at young age, experience higher local strains than those at older age. To test this hypothesis, we quantified the bone strains in the proximity of the lacunae using µCT image-based micro-finite element modeling and related those to lacunar shape in young and old mice. Our results showed that the mechanical environment of the osteocytes alters by the morphology of osteocyte lacunae. We found that larger, thinner and less longitudinally oriented lacunae experience higher maximum effective strains. Since osteocytes can sense matrix strains directly via their cell bodies, these local variations may affect the osteocyte mechanoresponse. Thus, we hypothesized that larger lacunae will enhance the osteocyte response to mechanical loading because they would be experiencing higher strains. To test this hypothesis, we related osteocyte lacunar morphology to bone mechano-biological response. Specifically, we investigated the response of osteocytes to mechanical loading in fibulae of two groups of mice having different lacunar morphology. Namely lactating mice, which have enlarged lacunae due to osteocytic osteolysis and age-matched virgin mice. The osteocyte mechanoresponse was measured by quantifying loading-related changes in sclerostin and β-catenin expression in osteocytes, as determined by immunohistochemistry. We found significantly less loading-induced sclerostin and more β-catenin expression by osteocytes residing in enlarged lacunae in the fibulae of lactating mice compared to those in virgin mice.

In conclusion, the data presented in this thesis provide evidence that osteocyte lacunar morphology affects bone mechanoresponse. Specifically, the data imply that osteocytes located in smaller lacunae will experience lower strains than those in larger lacunae and will respond less to identical mechanical loading. They also indicate that, at least in part, smaller lacunae such as found in aged bones are a potential causative factor for the reduced bone mechanoresponsiveness seen with aging, hence, are a potential causative factor for age-related bone loss that leads to osteoporosis. The results described in this thesis contribute to opening a new research direction in bone mechanobiology and provide more insight on the role of osteocyte lacunar morphology on functional bone adaptation and the disturbed bone remodeling process at old age. It is therefore promising for elucidating a pathway in the etiology of osteoporosis.

Osteoporose is een botziekte die sterk leeftijdsafhankelijk is. De kenmerken van osteoporose zijn een lage botmassa en botsterkte, hetgeen het risico op breuken verhoogt. Osteoporose ontstaat door een onbalans in het botremodeleringsproces waarbij meer bot wordt afgebroken dan gevormd. Het wordt aangenomen dat dit proces gecontroleerd wordt door osteocyten die de activiteit van osteobloasten, de botvormende cellen, en van osteoclasten, die botafbrekende cellen, sturen. Osteocyten bevinden zich in holtes (lacuna) in de botmatrix en worden onderling verbonden door celuitlopers die zich in smalle kanalen (canaliculi) liggen. Via dit uitgebreide communicatienetwerk registreren de osteocyten mechanische belasting op botten. Osteocyten zijn in staat om hun eigen micro-omgeving te wijzigen door het verwijderen en toevoegen van bot aan de oppervlakte van de lacunae. Het is aangetoond dat met toenemende leeftijd en bij verschillende botpathologien de lacunae morfologische veranderingen ondergaan. Of deze veranderingen de transmissie van mechanische signalen naar osteocyten beïnvloeden is niet geweten. Maar als ze het zouden beïnvloeden, dan kan de regulatieverstoring van het botremodelleringproces zoals die optreedt bij veroudering, het gevolg zijn van een verminderd vermogen van de osteocyten om de mechanische stimuli te detecteren en/of erop te reageren. Om dit te onderzoeken, was de centrale hypothese van deze thesis dat veranderingen in de morfologie van osteocyte lacunae zou leiden tot veranderingen in de mechanische conditie ervaren door de osteocyte, hetgeen dan zou leiden tot een veranderde respons op een mechanische belasting. Om deze hypothese te testen werden vier doelen gedefinieerd:​ (i) kwantificeren van de morfologie van individuele osteocyte lacunae, (ii) kwantificeren van leeftijdgerelateerde veranderingen in de morfologie van osteocyte lancunae, (iii) relateren van de lokale mechanische rekken in het bot aan de morfologie van osteocyte lacunae, en (iv) relateren van de morfologie van de osteocyte lacunae aan de mechanobiologische respons van bot.

Om deze doelen te bereiken, hebben we een methode ontworpen voor drie-dimensionale (3D) beeldvorming, segmentatie en kwantificatie van het osteocyte lacuna netwerk in muizenbot door gebruik te maken van hoge resolutie micro-computed tomografie (µCT). We hebben verder de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid bepaald van de corticale botmicrostructuurparameters via μCT. We concludeerden dat desktop μCT een waardevolle methode is om, in muizenbotten, de lacunae en vasculaire kanalen in 3D te kwantificeren, en dit met een hoge nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. Door gebruik te maken van deze 3D beeldvormingsmethode hebben we potentiële leeftijdgerelateerde variaties in de 3D morfologie van de osteocyte lacuna netwerk in de fibulae van jonge en oude muizen onderzocht. We vonden dat osteocyte lacuna kleiner en meer sferisch worden bij het ouder worden. Aangezien variaties in grootte en vorm van de lacunae veranderingen kunnen veroorzaken in de lokale mechanische omgeving van de osteocyten, leidde deze observatie tot de hypothese dat lacunae met een groot volume en een lage sfericiteit, zoals gevonden bij jonge leeftijd, grotere lokale rekken ervaren dan deze bij oudere leeftijd. Om deze hypothese te testen, hebben we de rekken in bot gekwantificeerd in de omgeving van de lacuna door gebruik te maken van microCT-gebaseerde micro eindige elementen modellering en dit gerelateerd aan de vorm van de lacunae in jonge en oude muizen. Onze resultaten toonden aan dat de mechanische omgeving van de osteocyten verandert als gevolg van de morfologie van de osteocyte lacunae. We vonden dat grotere, dunnere en minder longitudinale georiënteerde lacunae hogere effectieve rekken ondervinden. Aangezien de osteocyten de rekken in de botmatrix rechtstreeks kunnen detecteren via hun cellichaam, kunnen deze lokale variaties de osteocyte mechanorespons beïnvloeden. Specifiek onderzochten we de respons van de osteocyten als gevolg van mechanische belasting in de fibulae van twee groepen muizen die een verschillende morfologie van hun lacunae hebben, namelijk zogende muizen, die vergrootte lacunae hebben door osteocitische osteolyse en maagdelijke muizen van een gelijkaardige leeftijd. We maten middels immunohistochemie de mechanorespons van osteocyten door de expressie in sclerostine en β-catenin te kwantificeren. Na belasting vonden we in osteocyten in de fibula van zogende muizen een significant lagere sclerostine expressie en hogere β-catenin expressie in vergelijking met maagdelijke muizen.

Als conclusie kan getrokken worden dat de in deze thesis gepresenteerde data evidentie geeft dat de morfologie van osteocyte lacunae de mechanorespons van bot beïnvloedt. Specifiek impliceert de data dat osteocyten gelegen in smallere lacuna lagere rekken zullen ondervinden dan deze in grotere lacuna en minder zullen reageren op een gelijkaardige mechanische belasting. Ze tonen ook aan, in ieder geval gedeeltelijk, dat kleinere lacuna zoals gevonden in ouder bot, een potentieel causatieve factor zijn voor leeftijdgerelateerd botverlies dat leidt tot osteoporose. De resultaten beschreven in deze thesis dragen bij tot de start van een nieuwe onderzoeksrichting in de botmechanobiologie en geven meer inzicht in de rol van de morfologie van osteocyte lacunae op functionele botadaptie en het veranderde botremodelleringproces op oudere leeftijd. Het is daarom veelbelovend om meer inzicht te krijgen in de etiologie van osteoporose.