Joining dissimilar materials is a challenging and frequent requirement in nature as well as in engineering. Thanks to evolution and natural selection through millions of years, biological materials have probed different strategies to fulfill such task, hence becoming a source of inspiration and curiosity for a broad range of researchers. A fascinating example actually lies in the human body and is called the enthesis. This region is essential for the musculoskeletal system, ensuring efficient transitions at the interfaces between soft tissues and bones, often through a layer of fibrocartilage. Entheses therefore have a crucial role for the healthy functioning of our joints, yet they are much less investigated than single individual tissues such as tendon or bone. Limited regeneration abilities leading to poor clinical outcomes in case of reattachment surgeries, combined with injuries, inflammation and degenerative changes make entheses highly relevant in the clinical context.
In this thesis, we propose a multimodal correlative investigation of the tendon-bone interface, with the global aim to enrich the understanding of enthesis structure and properties. As biological system, the Achilles tendon insertion into calcaneus bone of adult rats is analyzed. This anatomical location does not only feature fibrocartilage at the enthesis, anchoring tendon to bone, but also another fibrocartilage, called periosteal, facilitating tendon sliding. The two tissues are adjacent but sustain distinct mechanical loading, and are therefore a valid model system to explore the impact of the mechanical environment on tissue properties at different hierarchical level.
Micro-computed tomography (micro-CT) at two different length scales, combined with histology and electron microscopy imaging, highlight specificities of tissue organization, microstructure and microporosity at enthesis and periosteal regions. We show that the insertion of the tendon occurs at a dedicated bony protrusion that also allows a direct loading transfer from the tendon to the plantar fascia without the involvement of other regions of the calcaneus bone. A strong structural anisotropy of bone vascular channels can be observed within the tuberosity, which is also a characteristic feature of fibrochondrocyte lacunae, forming highly aligned columns. At the enthesis, a high roughness of the interface connecting unmineralized to mineralized fibrocartilage is additionally observed. Periosteal fibrocartilage exhibits very different features: besides reduced waviness at the mineralizing interface, the tissue is more heterogeneous and displays an isotropic channel network together with randomly arranged fibrochondroycte lacunae.
To further explore structure-property relationships within enthesis and periosteal fibrocartilage at the material level, we combined nanoindentation with second harmonic generation (SHG) and quantitative backscattered electron imaging (qBEI), allowing to spatially correlate mechanical properties with mineralization and fibrous matrix organization. SHG images show that microstructural anisotropy is mirrored into highly aligned fibers at the insertion, further impacting the local mechanical behavior. Indeed, anisotropic regions are associated with a close spatial correspondence between mineral content and tissue modulus and a remarkably constant spatial profile within mineralized fibrocartilage towards bone. Those findings suggest that the enthesis fibrocartilage should provide high strength to sustain the tensile loading of the tendon. The more isotropic porosity of periosteal area is also reflected in the arrangement of the collagenous matrix. Indeed, the tissue displays an intricate fiber organization which results in a gradual increase in tissue modulus, probably to resist compressive loading. Despite their distinct spatial modulation of mechanical properties, both fibrocartilages are less mineralized than bone and yet quite efficient as they attain their stiffness with less calcium that bone would require. Finally, qBEI images show a considerable entanglement between fibrocartilage and bone at the interface to increase anchoring ability.
Using a confocal laser scanning microscope on stained samples, a connection is then revealed at the enthesis, between trabecular bone marrow space and fibrocartilage, through vasculature perforating the interface. This pathway provides a crosstalk between the osteocyte lacuno-canalicular network and fibrochondrocytes. Indeed, canaliculi are stopped at the cement line anchoring fibrocartilage to bone (or slightly before) but densely decorate the perforating subchondral channels, the latter further reaching the fibrochondrocytes. Those connections are much more evident at the enthesis than within the periosteal fibrocartilage, where they are practically absent.
In conclusion, our findings suggest that anisotropy and interdigitations are key features of the enthesis, and that preferentially oriented channels have a crucial role in bone-fibrocartilage crosstalk. The specificities of structure-property relationships of enthesis and periosteal fibrocartilage, also compared with underlying subchondral bone, demonstrate the versatility and efficiency of this tissue.
Several paths could be followed to extend our study. First, other species including humans, as well as other entheses, should be analyzed to determine how the strategies we highlighted vary with animal size and anatomical site (and corresponding loading). Finite-element models are currently developed to provide more insights into the biomechanical implications of our findings. Finally, it would be highly valuable to implement our procedure in medically relevant scenarios such as over or unloading of the entheses, inflammation and ageing to observe possible changes in enthesis structure and properties.
Unir des matériaux fortement dissemblables est une nécessité fréquente mais complexe dans la nature ainsi qu’en ingénierie. Grâce à des millions d’années d’évolution et de sélection naturelle, les matériaux biologiques ont exploré de nombreuses stratégies afin de réaliser cette tâche, devenant ainsi une source d’inspiration et de curiosité pour une grande variété de chercheur·ses. Un exemple fascinant se trouve dans le corps humain et s’appelle l’enthèse. Cette région est indispensable au système musculosquelettique, assurant des transitions efficaces aux interfaces entre les tissus mous et les os, souvent par une couche de fibrocartilage. Les enthèses ont donc un rôle crucial dans le fonctionnement sain de nos articulations, et pourtant elles sont beaucoup moins étudiées que les tissus individuels tels que le tendon ou l’os. Des capacités de régénération limitées menant à de mauvais résultats cliniques en cas de chirurgie de réattachement, combinées à de potentielles lésions, de l’inflammation et des changements dégénératifs, rendent les enthèses très pertinentes dans un contexte clinique.
Dans cette thèse, nous proposons une étude multimodale corrélative de l’interface tendon-os, avec pour objectif global d’enrichir la compréhension scientifique de la structure et des propriétés des enthèses. Comme système biologique, l’insertion du tendon d’Achille dans l’os calcanéen de rats adultes est analysée. Ce site anatomique ne contient pas uniquement du fibrocartilage au niveau de l’enthèse, ancrant le tendon à l’os, mais également un autre fibrocartilage, appelé périostéal, facilitant le glissement du tendon. Les deux tissus sont adjacents mais sont soumis à des chargements mécaniques distincts, et représentent donc un modèle valide afin d’explorer l’impact de l’environnement mécanique sur les propriétés des tissus à différentes échelles hiérarchiques.
De la micro-tomographie assistée par ordinateur (micro-CT) à deux échelles distinctes, combinée à de l’histologie et de la microscopie électronique, ont mis en évidence les particularités de l’organisation, de la microstructure mais aussi de la microporosité des tissus à l’enthèse et dans la région périostéale. Nous montrons que l’insertion du tendon se produit dans une protubérance dédiée de l’os, ce qui permet également un transfert de charge direct du tendon vers le fascia plantaire, sans impliquer d’autres régions de l’os calcanéen. Une forte anisotropie structurelle des canaux vasculaires osseux peut être observée à l’intérieur de la tubérosité et est également une caractéristique des lacunes des fibrochondrocytes, formant des colonnes fortement alignées. À l’enthèse, une rugosité importante de l’interface connectant le fibrocartilage nonminéralisé et minéralisé est également observée. Le fibrocartilage périostéal possède des caractéristiques très différentes : en plus d’une ondulation réduite à l’interface de minéralisation, le tissu est plus hétérogène, et présente une isotropie du réseau de canaux ainsi que des lacunes des fibrochondrocytes arrangées aléatoirement.
Afin d’explorer les relations structure-propriété dans le fibrocartilage de l’enthèse et périostéal en termes de matériau, nous avons combiné de la nanoindentation avec de la génération de deuxièmes harmoniques (SHG) et de l’imagerie quantitative par électrons rétrodiffusés (qBEI), permettant de corréler spatialement les propriétés mécaniques avec le niveau de minéralisation et l’organisation de la matrice fibreuse. Les images SHG montrent que l’anisotropie microstructurelle se reflète dans des fibres hautement alignées au niveau de l’insertion, impactant de surcroît le comportement biomécanique local. En effet, les régions anisotropiques sont associées à une correspondance spatiale proche entre le contenu minéral et le module tissulaire, ainsi qu’un profil spatial remarquablement constant depuis l’interface entre le fibrocartilage non-minéralisé et minéralisé. Ces résultats suggèrent que le fibrocartilage de l’enthèse doit surtout fournir une force élevée afin de supporter la charge de traction du tendon. La porosité plutôt isotropique de l’aire périostéale se reflète également dans l’arrangement de la matrice de collagène. En effet, le tissu présente une organisation fibreuse complexe résultant en une augmentation graduelle du module tissulaire, probablement pour résister à la charge compressive. Malgré une modulation spatiale spécifique de leurs propriétés mécaniques, les deux fibrocartilages sont moins minéralisés que l’os et pourtant efficaces : ils atteignent leur raideur avec moins de calcium que ce dont l’os aurait besoin. Finalement, les images qBEI démontrent un enchevêtrement considérable à l’interface entre le fibrocartilage et l’os, afin d’augmenter les capacités d’ancrage.
À l’aide de microscopie confocale à balayage laser sur des échantillons teintés, une connexion est révélée à l’enthèse entre la moelle osseuse trabéculaire et le fibrocartilage, via le système vasculaire perforant l’interface. Cette voie permet la communication entre le réseau lacuno-canaliculaire des ostéocytes et les fibrochondrocytes. En effet, les canalicules s’arrêtent à la ligne de cémentisation ancrant le fibrocartilage dans l’os (ou juste avant), mais ornent densément les canaux sous-chondraux perforants, ces derniers atteignant finalement les fibrochondrocytes. Ces connexions sont évidentes à l’enthèse, et beaucoup moins dans le fibrocartilage périostéal où elles sont quasiment absentes.
En conclusion, nos résultats suggèrent que l’anisotropie et les enchevêtrements sont des aspects clés de l’enthèse, et que les canaux préférentiellement orientés ont un rôle crucial dans la communication osfibrocartilage. Les particularités des relations structure-propriété du fibrocartilage de l’enthèse et périostéal, également en comparaison avec l’os sous-chondral sous-jacent, démontrent la versatilité et l’efficacité de ce tissu.
Plusieurs chemins peuvent être empruntés afin d’étendre notre étude. Premièrement, d’autres espèces comme l’humain, ainsi que d’autres enthèses, devraient être analysées afin de déterminer comment les stratégies que nous avons mises en évidence varient avec la taille de l’animal et le site anatomique (et son chargement correspondant). Des modèles aux éléments finis sont actuellement en développement afin de fournir davantage d’éclaircissements sur les implications biomécaniques de nos résultats. Finalement, il serait très enrichissant d’implémenter notre procédure dans des scénarios pertinents d’un point de vue clinique, comme par exemple la surcharge ou décharge de l’enthèse, de l’inflammation ou du vieillissement afin d’observer les potentiels changements dans la structure et les propriétés de l’enthèse.