Biomineral crystal growth within extracellular fiber assemblies is regulated broadly and at fine scales by proteins and small molecules. While small-molecule and protein inhibitors broadly prevent soft and compliant tissues from mineralizing, release from this inhibition in the vertebrate skeleton occurs through local expression of enzymes that cleave these inhibitors. Mutations in these enzymes result in inhibitor accumulation leading to debilitating mineralization defects and losses of mechanical function. As an example of this in another biomineralizing fiber system, despite supersaturation of mineral ions within an avian hen’s uterus which allows for an entire eggshell to mineralize in under 24 hours, mineralization of the underlying eggshell membrane fibers is restricted to outermost fibers only. This instance of broad inhibition of a fibrous network from mineralization permits splitting of the membrane fiber layers to form a membrane-enclosed air sac at the blunt-end of an egg, essential for chick respiration at hatching.
Correlative, multi-scale imaging approaches are now in common use in structural biology studies. However, this is not generally the case for hard mineralized tissues such as bone and cartilage, or eggshell – cases where the fibrous matrix is permeated with a mineral phase that renders them difficult to analyze. Mechanical properties of mineralized fibrous biocomposites originate from nanoscale relations of their constituent parts, and often propagate across several hierarchical levels in 3D. This work utilizes multi-scale imaging approaches (including FIB-SEM serial-surface-view tomography combined with deep learning-assisted segmentation) to better understand at multiple levels how mineralization develops and is refined at the interface of various fibrous, collagen-based extracellular matrices that form biocomposites having diverse properties and functions. A particular emphasis is placed on lamellar bone and enthesis fibrocartilage where we compare the 4D trajectory of mineralization in normal mice to that as observed in Hyp mice (a model of the disease X-linked hypophosphatemia). In XLH/Hyp, inactivating mutation in the PHEX enzyme results in altered FGF23 signaling causing renal phosphate wasting, and accumulation locally of the mineralization-inhibiting protein osteopontin (OPN), PHEX’s physiologic substrate.
This work details a shared structural level of hierarchy across the microscale and in 3D of lamellar bone and enthesis fibrocartilage – that we have called crossfibrillar mineral tessellation. In normal bone and fibrocartilage, this type of crossfibrillar mineral unit originates via growth of small mineral foci in an otherwise unmineralized fibrous collagen matrix into close-packed micrometer-sized tesselles, with intervening narrow organic margins. In Hyp mice, defective crossfibrillar mineralization leads to delays and changes in mineral tesselle packing which can account mechanistically for bone deformations and buckling (pseudofractures) found in mice and patients. This study highlights how mineral-binding proteins and potentially other factors have the capacity to influence the trajectory of mineralization (mineral focus-to-tesselle), therefore contributing to fragility in skeletal disease, or contributing to matrix-specific mechanical adaptation. Indeed, tessellation of fiber-anchored unit structures is not unique to bone or fibrocartilage. At the avian eggshell-membrane interface, organic fibers of the shell membrane course through interfacial mineral units of the calcitic shell, providing a similar developmental, reciprocal anchorage system. In this case, fibers pass through shell mineral, and shell mineral in turn anchors the fibers with mineral protrusions (so-called mineral spikes and granules). Taken together, these findings in different tissues and structures provide a fundamental 3D morphological basis for understanding attachment mechanisms between inorganic mineral and organic fiber systems.
La croissance biominérale cristalline au sein des assemblages de fibres extracellulaires est régulée à grande et à petite échelle par des protéines et des petites molécules. Bien que l'inhibition générale de la minéralisation garantisse que les tissus mous et conciliants soient maintenus tel quel, l’arrêt de cette inhibition dans les squelettes vertébrés est assuré par l'expression spécifique cellulaire et tissulaire d'enzymes qui clivent localement ces inhibiteurs de minéralisation. Les mutations inactivatrices dans les gènes codant pour ces enzymes entraînent une accumulation d'inhibiteurs qui conduit à des défauts de minéralisation invalidants et à une perte de la fonction mécanique. En outre, malgré la sursaturation des ions minéraux dans l'utérus de la poule domestique, permettant la formation et minéralisation complète d'une coquille d'œuf en moins de 24 heures, la minéralisation des fibres de la membrane coquillière est limitée aux fibres les plus externes qui tapissent la partie intérieure de la coquille. Cet exemple d’inhibition générale de minéralisation d'un réseau fibreux permet aussi la séparation entre les couches de fibres membranaires pour former une chambre à air à l’intérieur de la membrane à l'extrémité arrondie de l’œuf, essentielle à la respiration du poussin au moment de l'éclosion. Les approches d'imagerie corrélatives multi-échelles sont maintenant couramment utilisées dans la recherche en biologie structurale.
Cependant, ce n'est généralement pas le cas pour les tissus minéralisés durs tels que l'os, le cartilage, ou la coquille d'œuf – pour lesquels la matrice extracellulaire fibreuse est imprégnée d'une phase minérale (hydroxyapatite pour l’os et le cartilage et calcite pour la coquille d’œuf) qui les rend difficiles à analyser. Les propriétés mécaniques des bio-composites fibreux minéralisés proviennent des relations de leurs composants à l'échelle nanométrique, relations qui se propagent souvent au moins à plusieurs niveaux de hiérarchie en 3D. Dans le présent travail, nous avons utilisé une variété d'approches d'imagerie à plusieurs échelles (y compris la tomographie de surface en série FIB-MEB combinée à la segmentation assistée par l'apprentissage profond) pour mieux comprendre comment la minéralisation se développe à plusieurs échelles et est affinée à l'interface (fronts de minéralisation) de diverses matrices extracellulaires fibreuses à base de collagène (dans l'os, le fibrocartilage, le tendon et la coquille d'œuf aviaire) pour former des bio-composites ayant des propriétés et fonctions diverses. Une attention particulière a été accordée à l'os lamellaire et le fibrocartilage de l'enthèse pour lesquels la trajectoire 4D de la minéralisation a été comparée chez des souris sauvages à celle observée chez des souris Hyp (étudiées comme modèle de la maladie de l'hypophosphatémie liée à l'X chez les humains, XLH). Chez cette souris mutante et chez les patients atteints de la XLH, des mutations dans le gène PHEX entraînent une perte d'activité de l’enzyme PHEX, résultant en une ostéomalacie (hypo-minéralisation). Cette dernière s’accomplit par une signalisation altérée de l’hormone circulante FGF23 provoquant une perte de phosphate rénal, et par l'accumulation locale d'ostéopontine inhibitrice de la minéralisation, substrat physiologique de PHEX, dans la matrice extracellulaire.
Ce travail identifie un niveau structurel hiérarchique commun à l'échelle microscopique et en 3D de l'os lamellaire et du fibrocartilage de l'enthèse - que nous avons appelé pavage minéral inter-fibrillaire (crossfibrillar mineral tessellation). Dans l'os sain, cette structure provient de la croissance de petits foyers minéraux dans une matrice extracellulaire fibreuse et collagénique autrement non minéralisée, puis évolue en un motif de pavage tessellé micrométrique étendu et compacté, s'étendant sur trois dimensions et laissant de petits espaces entre les dites tesselles. Chez les souris Hyp déficientes en PHEX ayant une accumulation d'ostéopontine inhibitrice dans la matrice extracellulaire et une perte de phosphate rénal, la minéralisation défectueuse entraîne des retards et des changements dans le pavage tesselé minéral inter- fibrillaire, qui peuvent apporter une explication mécanique relative aux déformations osseuses molles et aux flambages (pseudofractures) typiquement observés chez les souris mutantes Hyp et chez les patients atteints de la XLH. Cette étude met en évidence comment les protéines de liaison minérale et potentiellement d'autres facteurs ont la capacité d'établir et d'influencer la trajectoire saine de la minéralisation (du foyer minéral à la tesselle), qui défectueux, peuvent contribuer à la perte d'intégrité osseuse et performance mécanique dans les maladies squelettiques. Le pavage tesselé des structures unitaires ancrées dans les fibres n'est pas unique à l'os dans la nature, et nous avons également identifié ce même motif à l'attachement de l'enthèse dans le fibrocartilage calcifié. À l'interface entre la membrane et la coquille de l’'œuf chez les poulets domestiques, les fibres organiques de la membrane coquillère passent à travers des unités minérales interfaciales de la coquille calcitique, fournissant un système d'ancrage réciproque avec un développement similaire. Dans ce cas, les fibres traversent les minéraux de la coquille, qui ancrent à leur tour les fibres avec des protubérances minérales (appelées pics et granules minéraux). Dans l'ensemble, ces résultats dans différents tissus et structures fournissent une base morphologique fondamentale en 3D pour comprendre les mécanismes d'attachement entre les systèmes minéraux inorganiques et les fibres organiques.