Osteoporosis is a disease characterized by an excessive decrease in bone mass leading to an increased susceptibility to skeletal fracture and deformation. To treat the disease medical research is attempting to target genes which define osteoporosis using the mouse as a model. Owing to the recent deciphering of the mouse genome and the high homology that exists between the human and mouse genomes, inbred strains of mice represent ideal models for genetic studies. Using the mouse to identify genes implicated in the bone remodeling process could therefore lead to advances in understanding which may enable the precise regulation of genes and proteins responsible for particular bone phenotypes i.e. bone mineral density or bone strength. One interesting phenotype under investigation is the response of bone to mechanical loading or its ‘Mechano-sensitivity’. Mechanical loading is the most important physiological/environmental factor regulating bone mass and shape. It has been demonstrated in humans that cyclic overloading enhances bone mass in both cortical and trabecular components. An understanding of the biological pathways (from gene expression to protein function) governing load stimulated bone formation could provide opportunities to mimic or augment bone mechano-sensitivity using pharmacological agents thereby leading to the development of novel strategies in the management of osteoporosis. The goal of this thesis was therefore to establish an in vivo model in two genetically distinct mouse strains which exhibit contrasting degrees of mechanosensitivity so as to facilitate the study of load regulated genes in both cortical and trabecular bone. Furthermore we also sought to investigate the quantitative relationship between the micromechanical environment and subsequent bone morphology so as to better understand the drivers of load induced bone formation.

To investigate the genetic regulation of mechanical loading, a Caudal Vertebrae Axial compression Device (CVAD) was developed to mechanically stimulate the fifth caudal vertebrae (C5) of C57BL/6 (B6) and C3H/Hej (C3H) female mice via two pins inserted into the adjacent vertebrae (C4 and C6). Preliminary in vitro studies showed that the device was capable of delivering dynamic load profiles consisting of 14 bouts of 3’000 cycles at a frequency of 10Hz and maximum amplitude of 8N without compromising the structural integrity of the proposed loading configuration and with errors of less than 1%. The attachment of micro-strain gages to the cortical shell also showed that the applied dynamic load was successfully transmitted to the target vertebrae, despite the interconnecting, viscoelastic vertebral discs.

In vivo loading trials were performed in which both C3H and B6 strains were loaded dynamically (frequency:​ 10Hz, 3 times a week for 4 weeks) with amplitudes of 0N, 2N, 4N and 8N. For a load of 8N, at trabecular sites bone volume density (BV/TV) increased by 25.9% and 14.2%, relative to the 0N group in B6 and C3H strains respectively (P < 0.05) as measured by µCT. In the case of B6 mice this was accompanied by a significant global increase of 21.9% (P < 0.001) in trabecular thickness (Tb.Th) and local significant increases of up to 14.6% (P < 0.001) in trabecular number (Tb.N) suggesting that a fully anabolic model was obtained. At cortical sites a near significant 11% (P =0.06) global increase in bone volume (BV) was reported by the B6 loading group together with significant local changes of up to 17.6% (P < 0.001). No significant changes were reported at cortical sites for the C3H strain. This study showed that both in terms of absolute and percentage increases in bone mass B6 mice were more responsive to mechanical loading.

To investigate the relationship between the micromechanical environment and subsequent bone formation a combined experimental and computational approach was used. Here successfully validated FE models were used to determine both cortical and trabecular microstructural stresses and strains specific to the target vertebra. Mean regional strains from the target vertebrae were then correlated with a mean regional bone formation index, determined for the second loading study using B6 mice. For a load of 8N strong linear correlations were found to exist between the bone formation index and strain energy density (SED) for cortical bone (R² = 0.82, P < 0.001), however surprisingly no correlations existed for trabecular bone (R² = -0.072). Whilst contesting current theory and suggesting different mechanisms drive cortical and trabecular bone formation this study highlighted the disadvantages of cross sectional morphological data sets and the potential weakness of modeling the target vertebrae as a homogeneous, isotropic material.

In conclusion, by demonstrating that both mechanical load and genetic background regulate the degree of bone adaptation in vivo, the work of this thesis has successfully established a model for the study of load induced bone adaptation. This will facilitate future studies aimed at investigating the biochemical pathways involved in bone formation.

Osteoporose ist eine Skeletterkrankung, bei der sich die Knochenmasse verringert und eine poröse Knochenstruktur entsteht. Durch die verringerte Knochendichte sind die Knochen schwächer und anfälliger für Brüche und Deformationen. Um die Krankheit heilen zu können strebt die Medizinalforschung darauf hin, die für die Osteoporose verantwortlichen Gene zu eruieren. Dazu werden durch Inzucht erzeugte Mausstämme als Modell verwendet, welche genetisch identisch, entziffert und dem Menschen sehr ähnlich sind. Diese gelten als ideales Modell für genetische Studien. Die Identifikation der am Knochenumbau beteiligten Gene der Maus wird das Verständnis für die Krankheit fördern. Dies wiederum könnte die präzise Regulation der Gene und Proteine ermöglichen, welche für bestimmte Knochen Phänotypen wie zum Beispiel Knochendichte oder Knochenstärke verantwortlich sind.

Ein interessanter und in Untersuchung stehender Phänotyp ist die Reaktion des Knochens auf mechanische Belastung respektive seine „Mechano-Sensitivität“. Mechanische Belastung ist im physiologischen und umgebungsbedingten Bereich der wichtigste einzelne Faktor welcher die Knochenmasse und Knochenform reguliert. Beim Menschen wurde bereits gezeigt, dass zyklisches Überlasten die Knochenmasse im kortikalen wie auch im trabekulären Bereich erhöht. Verstünde man die biologischen Vorgänge (vom Ausdruck der Gene bis hin zur Funktion der Proteine) welche den durch stimulierende Belastungen hervorgerufenen Knochenaufbau leiten, dann könnten Möglichkeiten geschaffen werden um die Mechano-Sensitivität durch pharmakologische Medikamente nachzuahmen oder gar zu steigern. Dies könnte zu neuen Möglichkeiten und Strategien in der Behandlung von Osteoporose führen.

Das Ziel dieser Arbeit war deshalb die Etablierung eines Modells im lebenden Organismus in zwei genetisch unterschiedlichen Mausstämmen, welche gegensätzliche mechanosensitive Eigenschaften aufweisen. Dies erleichtert die Untersuchung von Genen, welche durch Belastungen reguliert sind, sowohl im kortikalen wie auch im trabekulären Knochen.

Zusätzlich gilt ein Augenmerk der Untersuchung der quantitativen Beziehung zwischen der micro-mechanischen Umgebung und der sich anpassenden Knochenmorphologie. Damit können die antreibenden Komponenten der belastungsinduzierten Knochenumwandlung besser verstanden werden. Um die genetische Regulation der mechanischen Belastung zu untersuchen wurde ein Gerät zur axialen Kompression der Schwanzwirbel entwickelt (Caudal Vertebrae Axial compression Device;​ CVAD). Dieses ermöglicht die mechanische Stimulation des fünften Schwanzwirbels (C5) und wurde an den weiblichen Mäusen der Stämme C57BL/6 (B6) und C3H/Hej (C3H) mittels zweier in die anliegenden Wirbelkörper eingeführten Nadeln angewendet. Vorausgehende in vitro Studien zeigten die Eignung des Gerätes zur Überbringung der dynamischen Belastungsprofile, welche aus 14 Wiederholungen zu je 3000 Zyklen bei einer Frequenz von 10 Hz und einer maximalen Amplitude von 8N bestehen. Dabei wird die strukturelle Integrität der gewünschten Belastungskonfiguration nicht beeinträchtigt und der Fehler beträgt weniger als 1%.

Dehnungsmessstreifen, welche direkt auf die kortikale Oberfläche geklebt wurden, zeigten zudem, dass die dynamische Belastung, trotz der angrenzenden, viskoelastischen Bandscheiben, erfolgreich auf den gewünschten Wirbelkörper übertragen wurde. Dynamische Belastungsversuche wurden in vivo an beiden Mausstämmen C3H and B6 durchgeführt (Frequenz:​ 10Hz, dreimal die Woche während 4 Wochen). Dabei wurden Amplituden von 2N, 4N und 8N verwendet. Bei einer Belastung von 8N erhöhte sich die trabekuläre Knochendichte (BV/TV), gemessen mittels µCT, um 25.9% und 14.2% in den Stämmen B6, respektive C3H (P < 0.05). Für den B6 Mausstamm war die Veränderung begleitet von einer signifikanten globalen Zunahme der trabekulären Dicke (Tb.Th) um 21.9% (P < 0.001) und einer signifikanten Zunahme der lokalen Anzahl Knochenbälkchen von bis zu 14.6% (P < 0.001), was auf ein vollkommen anabolisches Modell hindeutet. Für den kortikalen Bereich konnte für die belastete B6 Gruppe eine annähernd signifikante globale Zunahme des Knochenvolumens (BV) von 11% (P = 0.06) und eine signifikante lokale Zunahme um 17.6% (P < 0.001) gefunden werden. Keine signifikanten Veränderungen konnte im kortikalen Knochen für den C3H Stamm gefunden werden. Diese Studie zeigte, dass bezüglich absoluter und prozentualer Zunahme der Knochenmasse die B6 besser auf mechanische Belastungen ansprechen als C3H Mäuse.

Zur Untersuchung der Verbindung zwischen mikromechanischem Umfeld und damit verbundener Knochenumwandlung wurde ein kombinierter experimenteller und rechnerischer Ansatz angewendet. Erfolgreich validierte FE Modelle wurden verwendet um im vorgegebenen Wirbelkörper die kortikalen und trabekulären mikrostrukturellen Spannungen und Dehnungen zu berechnen. Die gemittelten regionalen Dehnungen im Wirbelkörper wurden anschliessend mit einem mittleren regionalen Knochenentwicklungsindex korreliert, welcher aus der zweiten Belastungsstudie an B6 Mäusen eruiert wurde. Bei einer Belastung von 8N konnten für den kortikalen Knochen überzeugende lineare Korrelationen zwischen dem Knochenentwicklungsindex und der spezifischen Verzerrungsenergie (SED) gefunden werden (R² = 0.82, P < 0.001). Erstaunlicherweise fand man aber für den trabekulären Knochen keine Korrelationen (R² = -0.072).

Währendem sich diese Studie mit bestehenden Theorien auseinandersetzt und auf verschiedene Mechanismen eingeht, welche die kortikale und trabekuläre Knochenbildung antreiben, zeigt sie auch deutlich die Nachteile von morphologischen Querschnittsdatensätzen und die mögliche Schwäche der homogenen und isotropen Materialmodellierung der Wirbelkörper auf. Zusammenfassend hat diese Doktorarbeit erfolgreich ein in vivo Modell hervorgebracht, welches zukünftige Studien zur Erforschung der biochemischen Pfade der Knochenbildung, erleichtern wird.