Although cell-based cartilage repair techniques date back to the 1990’s, when the first autologous chondrocyte implantation (ACI) was performed, a predictable, and phenotypically stable treatment of cartilage lesions, has remained elusive. Since its inception, ACI has undergone several generations of improvements, but still focuses on the application of autologous articular chondrocytes (ACs), which not only suffer from high donor variability, but also require a long expansion time and two surgical interventions. In order to simplify the treatment, a more readily available cell source with reproducible chondrogenic potential is required. The aim of this thesis is to establish an alternative cell source with the ability to form phenotypically stable cartilage.

The first part of this thesis focus on the application of mesenchymal stromal cells (MSCs) as an alternative to ACs. MSCs are present in many bodily tissues (e.g. bone marrow, adipose, and synovium), and can be isolated with high cell yields. Their high self-renewal potential together with the ability to differentiate into the three mesenchymal lineages (adipo, bone and cartilage) makes MSCs a promising cell source. Unfortunately, the chondrogenic induction of MSCs has not yet led to the formation of phenotypically stable cartilage but progresses towards endochondral ossification. We have investigated two approaches for hypertrophy inhibition:​ the application of parathyroid hormone-related protein (PTHrP), as well as the use of RNA interference (RNAi). Regulation of growth plate hypertrophy is under the tight control of PTHrP, which makes it an aĴractive cytokine for manipulating MSC chondrogenesis in vitro. We show that PTHrP efficiently inhibits hypertrophic genes such as collagen 10, but at the same time also downregulates the chondrogenic matrix production. This unspecific action led to the exploration of small interfering RNA (siRNA) with the potential to knock-down protein expression in a highly sequence-specific manner. γ-PGA-Phe nanoparticles (NPs) were used as a delivery vehicle to carry siRNA inside their core, or adsorbed on the surface-coated polycations (polyethyleneimine, DEAE-dextran and chitosan). While encapsulated siRNA yielded unstable NPs, its absorption was highly efficient. Chitosan-coated NPs efficiently entered the cells and delivered the siRNA into the cytoplasm.

The developed NPs showed potential in future RNAi therapeutics for MSC-based cartilage treatments, but their high regulatory requirements led us to reconsider the cell choice. We shifted the focus from undifferentiated cells towards immature chondrocytes with a more defined character. In a comparison of fetal epiphyseal chondrocytes (ECPs) with MSCs and ACs, the high chondrogenic potential of ECPs was demonstrated along with a phenotypic stability outperforming MSCs. The application of an allogenic cell source additionally provided a more predictable and reproducible outcome compared to autologous ACs or MSCs. Cartilage is, due to its avascular nature, an immune-isolated tissue, and thus allogenic treatments have been used for several decades. The high capacity for stable cartilage matrix production of ECPs makes them a cell source with great promise for next generation one-step cartilage treatments.

This thesis demonstrates that MSCs, despite their potential, are still a long way from clinical application. Immature cartilage, on the other hand, combines the benefit of a stable phenotype with off-the-shelf availability, advancing cartilage tissue engineering towards a fast and reproducible single step procedure.

Obwohl zellbasierte Techniken zur Knorpelregeneration aus den Neunzigerjahren stammen, als die erste autologe Chondrozytenimplantation (ACI) durchgeführt wurde, erwies sich ein vorhersehbares und phänotypisch stabiles Verfahren zur Behandlung von Knorpelverleĵungen schwer realisierbar. Seit seiner Erfindung durchlief ACI einige Verbesserungsstadien, aber der Fokus liegt nachwievor auf der Anwendung von autologen Gelenkchondrozyten (ACs), welche nicht nur von grossen Spenderunterschieden geprägt sind, sondern auch eine lange Proliferationsphase sowie zwei chirurgische Eingriffe bedingen. Zur Vereinfachung dieses Verfahrens wird leichter verfügbares zelluläres Ausgangsmaterial mit reproduzierbarem chondrogenen Potential benötigt. Das Ziel dieser Dissertation ist die Etablierung eines alternativen Zelltypen, welcher phänotypisch stabilen Knorpel zu bilden vermag.

Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Anwendung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) als Alternative zu den ACs. MSCs sind in vielen Körpergeweben (beipielsweise Knochenmark, FeĴgewebe und Synovium) vorhanden und können mit hohen Zellerträgen isoliert werden. Ihr grosses Potential zur Selbsterneuerung zusammen mit der Fähigkeit sich in die drei mesenchymalen Enwicklungslinien (FeĴgewebe, Knochen und Knorpel) zu differenzieren, macht die MSCs zu einem vielversprechenden Zelltypen. Die Chondrogenese der MSCs führt jedoch nicht zur Bildung von stabilem, sondern transientem, kalzifiziertem Knorpelgewebe. Wir untersuchten daher zwei Ansäĵe zur Hemmung dieser sogenannten Hypertrophie:​ Die Anwendung von “parathyroid hormone-related protein”(PTHrP) sowie die Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi). Die endochondrale Ossifikation wird in vivo streng kontrolliert durch PTHrP, was dieses zu einem aĴraktiven Cytokin für die Manipulation der in vitro Chondrogenese von MSCs macht. Wir zeigen, dass PHTrP die hyperthrophen Gene wie Kollagen 10 effizient hemmt, aber gleichzeitig die Produktion der Knorpelmatrix hindert. Diese unspezifische Wirkung führte uns zur Erkundung der siRNA (small interfering RNA), welche se quenzspezifisch die Protein-Expressionen blockiert. γ-PGA-Phe Nanopartikel (NPs) wurden als Träger für die siRNA benuĵt, welche im Kern eingekapselt oder auf die mit Polikationen (Polyethylenimin, DEAE-Dextran und Chitosan) beschichteten NPs absorbiert wurde. Während die Einkapselung der siRNA die NPs destabilisierte, war ihre Absorption höchst effizient. Die Chitosan-Beschichtung der NPs führte zu einer effizienten Aufnahme in das Zellinnere, wo die siRNA erfolgreich ins Cytoplasma abgegeben wurde.

Die entwickelten NPs zeigten Potential als zukünftige RNAi-Therapeutika in der Anwendung von MSC-basierten Knorpelbehandlungen, aber ihre hohen regulatorischen Anforderungen brachten uns zu einem Überdenken der Wahl des Zelltypen. Wir verlagerten daher den Fokus von undifferenzierten Zellen auf nicht voll ausgebildete Chondrozyten mit einem vordefiniertem Charakter. Der Vergleich von Chondrozyten der fetaler Epiphysenfuge (fetal epiphyseal chondrocytes, ECPs) mit MSCs und ACs, zeigte das hohe chondrogene Potential der ECPs zusammen mit einer phänotypischen Stabilität auf, welche MSCs klar übertrifft. Zusäĵlich bietet die Anwendung eines allogenen zellulären Ausgangsmaterials ein vorhersehbareres und reproduzierbareres Ergebnis verglichen mit autologen ACs oder MSCs. Knorpel ist aufgrund seiner avaskulären Beschaffenheit ein immun-isoliertes Gewebe was bereits seit einigen Jahrzehnten zur allogene Knorpelbehandlungen geführt hat. Aufgrund der hohen Fähigkeit der ECPs zur Produktion stabiler Knopelmatrix erweisen sich diese als verheissungsvollen Zelltypen für Knorpelbehandlungen der nächsten Generation, welche nur eine einzige Operation bedingen.

Diese Dissertation zeigt, dass MSCs troĵ ihrem grossen Potential noch weit von einer klinischen Anwendung entfernt sind. Ein noch nicht voll ausgebildeter Knorpel hingegen kombiniert den Vorteil eines stabilen chondrozytären Phänotyps mit der sofortigen Verfügbarkeit, wodurch die Bildung von Knorpelgewebe zu einem schnellen und reproduzierbaren, einstufigen Verfahren wird.