Bone has the fascinating ability to adapt itself to the mechanical loads under which it is placed. Bone formation and resorption are choreographed in space and time by cells inhabiting the bone matrix, the osteocytes. They sense the loads bone is subjected to and transduce these mechanical signals into biochemical signals, which are then relayed to bone forming and resorbing cells. To perform this function, osteocytes are regularly dispersed through the bone matrix, forming a vast interconnected cell network with an estimated ~42 billion cells in an average adult human skeleton. Each osteocyte is embedded in an ellipsoidal cavity within the bone matrix known as a lacuna. Cells are connected by numerous long dendritic processes that pass through narrow channels in the bone matrix, the canaliculi. These cavities and channels form the so-called lacuno-canalicular network (LCN), providing osteocytes with a three-dimensional (3D) microenvironment that is unique for any cell type in the body. Architectural parameters of the LCN (e.g. lacunar shape, size and alignment or the number of canaliculi per lacuna) have been observed to change due to different conditions such as ageing, skeletal location, lactation and bone diseases. These changes are likely to be important for osteocyte function, because the architecture of the LCN directly influences the mechanical loading patterns that embedded osteocytes experience.

Despite osteocytes’ central role in bone homeostasis, the exact nature of the mechanical signal they perceive and the mechanobiological mechanisms responsible for sensing this signal and subsequently transducing it are not understood comprehensively. Since in vivo studies of osteocytes are challenging due to their inaccessible location inside the LCN, in vitro models are an attractive alternative. A suitable model to investigate the function of osteocytes needs to mimic the 3D microenvironmental cues osteocytes experience inside the LCN, which is not the case in current in vitro osteocyte models. Therefore, this thesis aimed to establish a novel, biomimetic 3D osteocyte model in which osteocytes reside in an artificial microenvironment mimicking the LCN. Micro 3D printing by two-photon polymerization (2PP) was chosen to fabricate LCN-mimicking structures, as this method permits to manipulate the microenvironmental geometry in a controlled fashion and at high resolution, laying the foundations for investigating its influence on osteocyte biology. The presented thesis has been divided into three aims:​ (i) to establish a strategy for micro 3D printing of LCN-mimicking structures, (ii) the development of surface coating strategies to modify the biochemical environment of 3D in vitro osteocyte models, and (iii) to investigate osteocyte networks inside micro 3D printed lacuno-canalicular networks (µpLCNs) using functional live imaging.

As a first important step in establishing a novel micro 3D printed osteocyte model, we were able to show that OrmoComp® is a suitable material for the fabrication of LCN-mimicking structures intended for housing osteocytes. We found that OrmoComp® supports high cell viability (≥94.5%) over 5 weeks of culture and demonstrated its long-term biocompatibility with the osteocytic differentiation of the IDG-SW3 cell line by analyzing osteocytic gene expression. We then investigated the micro 3D printing process for fabricating µpLCNs. We found that effects such as vignetting, shrinking or memory effects can interfere with the printing of narrow, canaliculi-like channels. Optimization of the design, printing and processing parameters of the micro 3D printing process resulted in a strategy involving shape precompensation, prolonged development with intermittent developer exchange and critical point drying. With this strategy, we achieved good printing precision for µpLCN cavities with standard deviations of the axes lengths between 0.13 µm and 0.81 µm. In order to additionally provide biochemical cues resembling those inside the LCN, surface coating strategies for biomimetic coating of µpLCNs were explored. We could demonstrate that polydopamine pre-coating is a promising strategy for immobilizing proteins of the native osteocyte microenvironment on the surface of µpLCNs. Finally, we conducted a proof-of-concept study for the novel, biomimetic 3D in vitro osteocyte model developed in this thesis. We demonstrated that osteocytes cultured in µpLCNs for 24 hours display a typical, dendritic morphology and form interconnected networks. By functional live cell imaging, we could show that osteocytes in these networks are connected to each other through gap junctions, alike to the osteocyte network in bone. Furthermore, we demonstrated that geometry changes in µpLCNs can be used to elicit changes in osteocyte connectivity, volume and shape. With that, µpLCNs are the first platform that allows for osteocyte networks to be cultured in well-defined 3D geometriesin which the changes in lacuno-canalicular geometry observed in bone can be recapitulated.

In conclusion, we believe that the model system developed in this thesis is a powerful tool to study the function of osteocyte networks in a 3D microenvironment emulating the LCN in bone. This novel platform provides the community with a unique, efficient tool for studies of intercellular communication in osteocyte networks and of the role of LCN architecture in osteocyte physiology.

Knochen ist ein faszinierendes Gewebe, denn es hat die einzigartige Fähigkeit, sich den mechanischen Belastungen anzupassen, denen es ausgesetzt ist. Der dafür notwendige Aufbau und Abbau von Knochen wird von Osteozyten räumlich und zeitlich gesteuert und koordiniert. Diese Zellen liegen tief in der Knochenmatrix vergraben. Sie nehmen die Belastungen wahr, denen der Knochen ausgesetzt ist und wandeln diese mechanischen Signale in biochemische Signale um, die dann an die knochenbildenden und -resorbierenden Zellen weitergeleitet werden. Um diese Funktion zu erfüllen, sind die Osteozyten in gleichmässigen Abständen in der Knochenmatrix verteilt, wo sie ein riesiges Zellnetzwerk bilden, mit schätzungsweise ~42 Milliarden Zellen im Skelett eines durchschnittlichen Erwachsenen. Jeder Osteozyt liegt in einem eigenen ellipsoiden Hohlraum in der Knochenmatrix, der als Lakune bezeichnet wird. Die Osteozyten sind durch zahlreiche lange Dendriten miteinander verbunden, die durch dünne Kanäle in der Knochenmatrix verlaufen – die Canaliculi. Zusammen bilden diese Hohlräume und Kanäle das so genannte lakunocanaliculäre Netzwerk (LCN). Das LCN stellt die dreidimensionale (3D) Mikroumgebung der Osteozyten im Knochen dar. Die architektonischen Parameter des LCN (beispielsweise Form, Grösse und Ausrichtung der Lakunen oder die Anzahl von Canaliculi pro Lakune) können aufgrund verschiedener Bedingungen unterschiedlich sein, beispielsweise Alterung, Laktation, anatomischer Lage und Knochenerkrankungen. Es ist davon auszugehen, dass diese Unterschiede einen Einfluss auf die Funktion der Osteozyten haben, da die Architektur des LCN die mechanischen Belastungsmuster direkt beeinflusst, denen die darin eingebetteten Osteozyten ausgesetzt sind.

Obwohl die Osteozyten in der Knochenhomöostase eine zentrale Rolle spielen, sind viele Forschungsfragen noch offen. Beispielsweise ist nicht genau geklärt, welche mechanischen Signale Osteozyten wahrnehmen und welche mechanobiologischen Mechanismen für die Wahrnehmung und die Mechanotransduktion dieser Signale verantwortlich sind. Aufgrund ihrer unzugänglichen Lage tief im Knochen sind in vivo-Untersuchungen an Osteozyten eine grosse Herausforderung. In vitro-Modelle stellen eine attraktive Alternative dazu dar. Ein geeignetes Modell für funktionelle Untersuchungen von Osteozyten muss die Signale der 3D-Mikroumgebung nachahmen, welchen Osteozyten innerhalb des LCN ausgesetzt sind. Dies ist bei den meisten derzeit verfügbaren in vitro-Osteozytenmodellen nicht der Fall. Ziel dieser Dissertation war es daher, ein neuartiges biomimetisches 3D-Osteozytenmodell zu etablieren:​ Darin befinden sich die Osteozyten in einer künstlichen Mikroumgebung, welche die Geometrie des LCN nachahmt. Dafür wurden LCN-ähnliche Strukturen im Mikro-3D-Druck-Verfahren durch Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) hergestellt. Diese hochauflösende Methode erlaubt es, die Geometrie der zellulären Mikroumgebung genau zu kontrollieren, und damit die Grundlage für Untersuchungen ihres Einflusses auf die Funktionen von Osteozyten zu schaffen. Die Arbeit wurde in drei Ziele gegliedert:​ (i) die Etablierung einer Strategie für den Mikro-3D-Druck von LCN-ähnlichen Strukturen, (ii) die Entwicklung von Oberflächenbeschichtungsstrategien, um die biochemische Umgebung der 3D in vitro-Osteozytenmodelle zu verändern und (iii) die Untersuchung von Osteozytennetzwerken in mikro-3D-gedruckten lakuno-canaliculären Netzwerken (µpLCNs) mittels funktioneller Lebendzell-Mikroskopie.

Als ersten wichtigen Schritt für die Etablierung eines neuartigen mikro-3D-gedruckten Osteozytenmodells konnten wir zeigen, dass OrmoComp® ein geeignetes Material für die Herstellung von LCN-ähnlichen Strukturen zur Kultivierung von Osteozyten ist. Während der Kulturdauer von 5 Wochen weisen Osteozyten auf OrmoComp®-Oberflächen eine hohe Zellviabilität auf (≥94,5%). Zudem konnten wir durch Genexpressionsanalysen nachweisen, dass das Material biokompatibel mit der osteozytären Differenzierung der IDG-SW3- Osteozytenzelllinie ist. Anschliessend untersuchten wir den Mikro-3D-Druckprozess zur Herstellung von µpLCNs. Wir fanden heraus, dass Effekte wie Vignettierung, Schrumpfung oder «Memory»-Effekte Probleme beim Drucken der dünnen, canaliculi-ähnlichen Kanäle hervorrufen können. Wir optimierten die Design-, Druck- und Verarbeitungsparameter des Mikro-3D-Druckprozesses. Daraus ergab sich eine Verarbeitungsstrategie mit Formvorkompensation, einer verlängerten Entwicklungszeit mit mehrfachem Entwickleraustausch und Überkritischer Trocknung. Mit dieser Strategie wurde eine gute Druckgenauigkeit für die ellipsoidalen Mulden der µpLCNs erreicht, mit Standardabweichungen der Achsenlängen zwischen 0.13 µm und 0.81 µm. Um zusätzlich die biochemische Umgebung in den µpLCNs so verändern zu können, dass sie derjenigen im Inneren des LCN ähnlich ist, wurden Oberflächenbeschichtungsstrategien für die biomimetische Beschichtung von µpLCNs erforscht. Die Vorbeschichtung mit Polydopamin stellte sich als vielversprechende Strategie zur Immobilisierung von Proteinen der nativen Osteozyten-Mikroumgebung auf der Oberfläche von µpLCNs heraus. Schliesslich führten wir eine Proof-of-Concept-Studie für das biomimetische in vitro 3D-Osteozytenmodell durch, welches in dieser Arbeit entwickelt wurde. Darin konnten wir zeigen, dass Osteozyten nach 24 Stunden Kultur in µpLCNs eine typische, dendritische Morphologie aufweisen und verbundene Netzwerke bilden. Durch funktionelle Lebendzell-Mikroskopie konnten wir belegen, dass die Osteozyten in diesen Netzwerken durch Gap Junctions miteinander verbunden sind, so wie das im Osteozytennetzwerk im Knochen der Fall ist. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass Änderungen in der Geometrie der µpLCNs verwendet werden können, um Veränderungen der Form, des Volumens und der Anzahl Dendriten bei den Osteozyten zu induzieren. Damit sind die hier entwickelten µpLCNs die erste Plattform, die es erlaubt, Osteozytennetzwerke in definierten 3D-Geometrien zu kultivieren. Damit bieten sie die Möglichkeit, die im Knochen beobachteten Veränderungen der lakuno-canaliculären Geometrie nachzubilden.

Zusammenfassend sind wir der Meinung, dass unser neues in vitro 3D-Modellsystem ein wertvolles Werkzeug für funktionelle Studien an Osteozytennetzwerken ist, weil sich die Osteozyten darin in einer 3D-Mikroumgebung ähnlich dem LCN im Knochen befinden. Diese neuartige Plattform stellt Forschenden ein einzigartiges, effizientes Tool für Untersuchungen zur interzellulären Kommunikation in Osteozytennetzwerken und der Rolle der LCN-Architektur in der Osteozytenphysiologie zur Verfügung.