Osteoporosis is a metabolic disease that is characterized by an increased risk of skeletal fracture. While typically occurring in postmenopausal women, rare forms of the disease also manifest in younger premenopausal women such as idiopathic osteoporosis (IOP) and idiopathic low bone mineral density (ILBMD). The weakening of the skeletal system and subsequent increased fracture risk can be explained by a reduction of overall bone density as well as changes in the bone tissue microarchitecture. However, open questions remain regarding if and how the disease impacts bone on a cellular level – specially with respect to the morphology of the lacunar pores and their resident osteocytes. With recent developments in ultra-high-resolution micro-computed tomography (microCT), it is now possible to image embedded threedimensional (3D) structures with a resolution on the order of one micrometer. This technology is uniquely positioned to image the cellular structures of ex-vivo bone biopsies, such as lacunae, with the resolution and scale of synchrotron computed tomography (SR-CT) without requiring an entire beamline facility. However, a rigorously validated methodology to image lacunar pores using ultra-high-resolution microCT remains to be developed.
Therefore, this thesis has been divided into three aims: (i) To develop a method to perform large-scale quantification of osteocyte lacunar morphological biomarkers (ii) To develop a method for the in silico quantification of osteocyte lacunar mechanical biomarkers (iii) To create osteocyte lacunar biomarkers for the characterization of human rare bone diseases.
With respect to the first aim, a method was developed to image, extract, and measure lacunar morphometries. First, a novel sample preparation methodology was developed to machine embedded human bone biopsies into a cylindrical format that fits within the physical constraints of the microCT device. Image acquisition was next optimized to create high quality images with clearly visible lacunae, which involved parameters such as x-ray beam energy and filter selection. Following image acquisition, a sample-specific imaging threshold was then applied to binarize the image and segment lacunar structures. Finally, 3D morphometric parameters were measured in both cortical and trabecular regions of a group of 31 transiliac biopsies originating from healthy premenopausal women. Lacunar morphometric parameters were categorized as global, local, and population-based measurements. Rigorous validation was performed for the entire methodology and included measures of lacunar detection accuracy (true positives (TP), false positives (FP), false negatives (FN)), reproducibility (precision error (PE) and intraclass correlation coefficients (ICC)), and biological sensitivity (detectible lacunar differences between regions of cortical and trabecular bone).
The second aim investigated the biomechanical significance of the embedded lacunar structures. Two computational models were created that simulate microcrack initiation and propagation through mineralized bone tissue, which ultimately intersected several lacunae. These models were constructed by combining the microCT image data with micro-finite element analysis (microFE). The first model, called the microcrack gradient model (MGM), was based purely on 3D mechanical gradients derived from the original microCT image density values. The second model, named the scissor model (SM), explored the hypothetical release of interstitial fluid from the dense network of canaliculi as a microcrack propagates through the tissue matrix. Both models had unique advantages and disadvantages, however, the microcracking simulated with the SM resembled previous experimental results more closely than with the MGM.
The third and final aim of this thesis was to apply the validated imaging methodology developed in the first aim to a large set (103 in total) of three cohorts of transiliac bone biopsies: healthy cohort (n=39), IOP cohort (n=45), and ILBMD cohort (n=19). This was a true large-scale application of the imaging methodology, and the analysis included a total of 26.2 million lacunae. While lacunar morphometries did not significantly differ between cohorts, lacunae in cortical bone were significantly larger, flatter, and more densely packed together than in trabecular regions. This data corroborated the results of the lacunae examined in the first aim, which displayed the same trend of lacunar morphometries between regions in a healthy cohort. Across all three cohorts, lacunar sphericity was strongly negatively correlated with bone volume (BV/TV). While only a cross-sectional study, this strong correlation indicates that lacunar morphology is indeed connected with BV/TV. Finally, the same analysis was applied to the healthy cohort (n=39), but grouped according to adiposity (nlow = 13, nmid = 14, nhigh = 12). Similar to the first biopsy grouping, lacunar morphology differed between cortical and trabecular regions, but not between adiposity tertiles. Furthermore, a strong negative correlation persisted regarding lacunar sphericity and BV/TV.
To conclude, the application of the large-scale lacunar imaging methodology using microCT was successful and improved our understanding of lacunar morphology in premenopausal women suffering from rare forms of osteoporosis. Firstly, the imaging methodology was demonstrated to be able to measure lacunar morphometries accurately, reproducibly, and sensitively in human transiliac bone biopsies using microCT technology. Secondly, the biomechanical importance of lacunar structures in the mineralized bone matrix with respect to simulated microcracking was explored and the importance of the canalicular network was highlighted. Finally, the validated lacunar imaging methodology was applied to both healthy vs. affected cohorts (healthy, IOP, ILBMD) as well as to the healthy cohort alone but divided into tertiles based on adiposity. Ultimately, the development, validation, and application of this large-scale lacunar imaging methodology using widely accessible microCT technology has two main accomplishments: it has revealed new insights into the lacunar morphology of premenopausal women with rare forms of osteoporosis and it has also empowered researchers with access to microCT systems to explore additional hypotheses related to lacunar morphology.
Osteoporose ist eine metabolische Erkrankung, die durch ein erhöhtes Risiko für Knochenbrüche gekennzeichnet ist. In der Regel tritt sie bei Frauen nach der Menopause auf, jedoch manifestieren sich seltene Formen der Krankheit auch bei jüngeren Frauen vor der Menopause, wie die idiopathische Osteoporose (IOP) und die idiopathische niedrige Knochenmineraldichte (ILBMD). Die Schwächung des Skelettsystems und das damit verbundene erhöhte Frakturrisiko lassen sich durch eine Verringerung der Gesamtknochendichte sowie durch Veränderungen der Mikroarchitektur des Knochengewebes erklären. Es bleiben jedoch Fragen offen, ob und wie sich die Krankheit auf zellulärer Ebene auf den Knochen auswirkt - insbesondere im Hinblick auf die Morphologie der lakunären Poren und der darin lebenden Osteozyten. Mit den jüngsten Entwicklungen in der ultrahochauflösenden Mikro-Computertomographie (mikroCT) ist es nun möglich, eingebettete dreidimensionale (3D) Strukturen mit einer Auflösung in der Größenordnung von einem Mikrometer abzubilden. Diese Technologie ist in der Lage, die zellulären Strukturen von Exvivo-Knochenbiopsien, wie z. B. Lakunen, mit der Auflösung und dem Maßstab der Synchrotron-Computertomographie (SR-CT) abzubilden, ohne dass eine ganze BeamlineAnlage erforderlich ist. Eine rigoros validierte Methodik zur Abbildung von Lakunenporen mittels ultrahochauflösender Mikro-CT muss jedoch erst noch entwickelt werden.
Deshalb wurde diese Arbeit in drei Ziele unterteilt: (i) Entwicklung einer Methode zur großmaßstäblichen Quantifizierung von morphologischen Biomarkern für Lakunen (ii) Entwicklung einer Methode zur In-silico-Quantifizierung von mechanischen Biomarkern für Lakunen (iii) Entwicklung von Biomarkern für Lakunen zur Charakterisierung seltener menschlicher Knochenerkrankungen.
In Bezug auf das erste Ziel wurde eine Methode zur Abbildung, Extraktion und Messung der Morphometrie von Lakunen entwickelt. Zunächst wurde eine neuartige Probenvorbereitungsmethode entwickelt, um eingebettete menschliche Knochenbiopsien in ein zylindrisches Format zu bringen, das in die räumlich beschränkte Probenkammer des mikroCT-Geräts passt. Anschließend wurde die Bildaufnahme optimiert, um qualitativ hochwertige Bilder mit deutlich sichtbaren Lakunen zu erzeugen, wobei Parameter wie die Röntgenstrahlenenergie und die Filterauswahl berücksichtigt wurden. Nach der Bildaufnahme wurde ein für jede Probe spezifischer Schwellenwert angewendet, um das Bild zu binarisieren und die Lakunenstrukturen zu segmentieren. Schließlich wurden die morphometrischen 3DParameter sowohl in den kortikalen als auch in den trabekulären Regionen einer Gruppe von 31 transiliakalen Biopsien von gesunden prämenopausalen Frauen gemessen. Die lakunären morphometrischen Parameter wurden als globale, lokale und populationsbasierte Messungen kategorisiert. Die gesamte Methodik wurde einer strengen Validierung unterzogen und umfasste Messungen der Erkennungsgenauigkeit von Lakunen (echte Positive (TP), falsch Positive (FP), falsch Negative (FN)), der Reproduzierbarkeit (Präzisionsfehler (PE) und Intraclass-Korrelationskoeffizienten (ICC)) und der biologischen Sensitivität (nachweisbare Uunterschiede der Lakunen zwischen Regionen aus kortikalem und trabekulärem Knochen).
Das zweite Ziel war die Untersuchung der biomechanischen Bedeutung der eingebetteten lakunären Strukturen. Es wurden zwei Berechnungsmodelle erstellt, die die Entstehung und Ausbreitung von Mikrorissen im mineralisierten Knochengewebe simulieren, welche schließlich mehrere Lakunen durchschnitten. Diese Modelle wurden durch Kombination der mikroCT-Bilddaten mit der Finite-Elemente-Mikroanalyse (mikroFE) erstellt. Das erste Modell, das so genannte Mikroriss-Gradienten-Modell (MGM), basierte ausschließlich auf mechanischen 3D-Gradienten, die aus den ursprünglichen Dichtewerten der mikroCT-Bilder abgeleitet wurden. Das zweite Modell, das so genannte Scherenmodell (SM), untersuchte die hypothetische Freisetzung von interstitieller Flüssigkeit aus den dendritischen Kanälchen des dichten Netzwerks, wenn sich ein Mikroriss durch die Gewebematrix ausbreitet. Beide Modelle hatten eindeutige Vor- und Nachteile, doch die mit dem SM simulierten Mikrorisse ähnelten früheren experimentellen Ergebnissen mehr als die des MGM.
Das dritte und letzte Ziel dieser Arbeit war die Anwendung der validierten Bildgebungsmethode, die im ersten Ziel entwickelt wurde, auf eine grosse Probenmenge (insgesamt 103) von drei Kohorten von transiliakalen Knochenbiopsien: gesunde Kohorte (n=39), IOP-Kohorte (n=45) und ILBMD-Kohorte (n=19). Dabei handelte es sich um eine wirklich groß angelegte Anwendung der Bildgebungsmethode, und die Analyse umfasste insgesamt 26,2 Millionen Lakunen. Während sich die Morphometrien der Lakunen zwischen den Kohorten nicht signifikant unterschieden, waren die Lakunen im kortikalen Knochen signifikant größer, flacher und dichter gepackt als in trabekulären Regionen. Diese Daten bestätigten die Ergebnisse zu den im Rahmen des ersten Ziels untersuchten Lakunen, die in einer gesunden Kohorte denselben Trend der Lakunenmorphometrie zwischen den Regionen aufwiesen. In allen drei Kohorten war die lakunäre Sphärizität stark negativ mit dem Knochenvolumen (BV/TV) korreliert. Obwohl es sich nur um eine Querschnittsstudie handelt, deutet diese starke Korrelation darauf hin, dass die Lakunenmorphologie tatsächlich mit dem BV/TV zusammenhängt. Schließlich wurde dieselbe Analyse auf die gesunde Kohorte (n=39) angewandt, jedoch gruppiert nach Adipositas (nlow = 13, nmid = 14, nhigh = 12). Ähnlich wie bei der ersten Biopsiegruppierung unterschied sich die Lakunarmorphologie zwischen kortikalen und trabekulären Regionen, jedoch nicht zwischen den Tertilen der Adipositas. Außerdem bestand eine starke negative Korrelation zwischen der Sphärizität der Lakunen und dem BV/TV.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anwendung der groß angelegten Bildgebungsmethode für Lakunen mittels mikroCT erfolgreich war und unser Verständnis der Lakunenmorphologie bei prämenopausalen Frauen, die an seltenen Formen der Osteoporose leiden, verbessert hat. Erstens konnte gezeigt werden, dass die Bildgebungsmethode in der Lage ist, die Lakunenmorphologie in menschlichen transiliakalen Knochenbiopsien mit der mikroCT-Technologie genau, reproduzierbar und empfindlich zu messen. Zweitens wurde die biomechanische Bedeutung von lakunären Strukturen in der mineralisierten Knochenmatrix im Hinblick auf simulierte Mikrorisse untersucht. Schließlich wurde die validierte Bildgebungsmethode für lakunäre Strukturen sowohl auf gesunde und erkrankte Kohorten (gesund, IOP, ILBMD) als auch auf die gesunde Kohorte allein, jedoch unterteilt in Tertile auf der Grundlage der Adipositas, angewendet. Letztendlich erbrachte die Entwicklung, Validierung und Anwendung dieser groß angelegten Lakunan-Imaging-Methode unter Verwendung der weithin zugänglichen mikroCT-Technologie zwei wesentliche Ergebnisse: Sie ermöglichte neue Einblicke in die Lakunanmorphologie prämenopausaler Frauen mit seltenen Formen der Osteoporose und versetzte Forscher mit Zugang zu mikroCT-Systemen in die Lage, zusätzliche Hypothesen zur Lakunanmorphologie zu untersuchen.