Fracture repair is a complex and multifactorial process, which involves a well-programmed series of cellular and molecular events that result in a combination of intramembranous and endochondral bone formation. The vast majority of fractures is treated successfully. They heal through ‘secondary healing’, a sequence of tissue differentiation processes, from initial haematoma, to connective tissues, and via cartilage to bone. However, the process can fail and this results in delayed healing or non-union, which occur in 5-10% of all cases. A better understanding of this process would enable the development of more accurate and rational strategies for fracture treatment and accelerating healing. Impaired healing has been associated with a variety of factors, related to the biological and mechanical environments. The local mechanical environment can induce fracture healing or alter its biological pathway by directing the cell and tissue differentiation pathways. The mechanical environment is usually described by global mechanical factors, such as gap size and interfragmentary movement. The relationship between global mechanical factors and the local stresses and strains that influence cell differentiation can be calculated using computational models.

In this thesis, mechano-regulation algorithms are used to predict the influence of mechanical stimuli on tissue differentiation during bone healing. These models used can assist in unraveling the basic principles of cell and tissue differentiation, optimization of implant design, and investigation of treatments for non-union and other pathologies. However, this can only be accomplished after the models have been suitably validated. The aim of this thesis is to corroborate mechanoregulatory models, by comparing existing models with well characterized experimental data, identify shortcomings and develop new computational models of bone healing. The underlying hypothesis throughout this work is that the cells act as sensors of mechanical stimuli during bone healing. This directs their differentiation accordingly. Moreover, the cells respond to mechanical loading by proliferation, differentiation or apoptosis, as well as by synthesis or removal of extracellular matrix.

In the first part of this work, both well-established and new potential mechano-regulation algorithms were implemented into the same computational model and their capacities to predict the general tissue distributions in normal fracture healing under cyclic axial load were compared. Several algorithms, based on different biophysical stimuli, were equally well able to predict normal fracture healing processes (Chapter 3). To corroborate the algorithms, they were compared with extensive in vivo experimental bone healing data. Healing under two distinctly different mechanical conditions was compared:​ axial compression or torsional rotation. None of the established algorithms properly predicted the spatial and temporal tissue distributions observed experimentally, for both loading modes and time points. Specific inadequacies with each model were identified. One algorithm, based on deviatoric strain and fluid flow, predicted the experimental results the best (Chapter 4). This algorithm was then employed in further studies of bone regeneration. By including volumetric growth of individual tissue types, it was shown to correctly predict experimentally observed spatial and temporal tissue distributions during distraction osteogenesis, as well as known perturbations due to changes in distraction rate and frequency (Chapter 5).

In the second part of this work, a novel ‘mechanistic model’ of cellular activity in bone healing was developed, in which the limitations of previous models were addressed. The formulation included mechanical modulation of cell phenotype and skeletal tissue-type specific activities and rates. This model was shown to correctly predict the normal fracture healing processes, as well as delayed and non-union due to excessive loading, and also the effects of some specific biological perturbations and pathological situations. For example, alterations due to periosteal stripping or impaired cartilage remodeling (endochondral ossification) compared well with experimental observations (Chapter 6). The model requires extensive parametric data as input, which was gathered, as far as possible, from literature. Since many of the parameter magnitudes are not well established, a factorial analysis was conducted using ‘design of experiments’ methods and Taguchi orthogonal arrays. A few cellular parameters were thereby identified as key factors in the process of bone healing. These were related to bone formation, and cartilage production and degradation, which corresponded to those processes that have been suggested to be crucial biological steps in bone healing. Bone healing was found to be sensitive to parameters related to fibrous tissue and cartilage formation. These parameters had optimum values, indicating that some amounts of soft tissue production are beneficial, but too little or too much may be detrimental to the healing process (Chapter 7).

The final part of this work focused on the remodeling phase of bone healing. Long bone postfracture remodeling in mice femora was characterized, including a new phenomenon described as ‘dual cortex formation’. The effect of mechanical loading modes on fracturecallus remodeling was evaluated using a bone remodeling algorithm, and it was shown that the distinct remodeling behavior observed in mice, compared to larger mammals, could be explained by a difference in major mechanical loading mode (Chapter 8).

In summary, this work has further established the potential of mechanobiological computational models in developing our knowledge of cell and tissue differentiation processes during bone healing in general, and fracture healing and distraction osteogenesis in particular. The studies presented in this thesis have led to the development of more mechanistic models of cell and tissue differentiation and validation approaches have been described. These models can further assist in screening for potential treatment protocols of pathophysiological bone healing.

Het herstel van botfracturen verloopt volgens een complex proces waarbij cellulaire en moleculaire activiteiten een rol spelen. Normaal volgt dit een proces van weefseldifferentiatie waarbij het hematoom dat direct na de breuk ontstaat geleidelijk verandert in bindweefsel, kraakbeen, en tenslotte volledig functioneel botweefsel. Echter, in 5-10% van de gevallen verloopt de fractuurheling zeer traag, onvolledig of geheel niet. Om zulke probleemgevallen adequaat te kunnen behandelen is een beter begrip nodig van de processen tijdens botheling. Biologische of mechanische omstandigheden tijdens het helingsproces beïnvloeden botheling. Zo heeft mechanische belasting een direct effect op de cel- en weefseldifferentiatie. Dit proces heet mechanoregulatie. Mechanische belasting wordt tijdens fractuurheling meestal niet op cel- maar op orgaanniveau beschreven, bijvoorbeeld als afstand en frictie tussen de botdelen. De vertaalslag van deze globale factoren naar lokale spanningen en rekken in het weefsel die de differentiatie van cellen beïnvloedt, vereist numerieke modellen. Diverse hypothetische algoritmen zijn gebruikt om te verklaren hoe deze lokale spanningen en rekken de weefseldifferentiatie beïnvloeden. Het toepassingsgebied van dergelijke algoritmen is zeer groot. Ze kunnen helpen bij het ontrafelen van basisprincipes van cel- en weefseldifferentiatie, het optimaliseren van implantaten en het zoeken naar potentiële behandelingen voor niethelende botbreuken of andere aandoeningen waarbij botvorming een rol speelt. Echter, een correcte voorspelling van het botvormingsproces vereist een degelijke validatie van deze computermodellen.

In dit proefschrift zijn verschillende mechanoregulatie algoritmen onderzocht en gevalideerd. Daartoe zijn voorspellingen op basis van in de literatuur beschreven algoritmen vergeleken met experimentele resultaten, onvolkomenheden in de voorspellingen geïdentificeerd, en verbeteringen voorgesteld. De onderliggende hypothese van al deze algoritmen is dat cellen als sensoren functioneren tijdens de fractuurheling. Ze registreren de mechanische belasting en gebruiken die informatie om de weefseldifferentiatie te sturen door te prolifereren, differentiëren of apoptotisch te worden en door hun extracellulaire matrix aan te passen.

In het eerste deel van deze studie werden bestaande en nieuwe mechanoregulatie algoritmen geïmplementeerd in een numeriek model om het normale fractuurhelingsproces onder axiale belasting te voorspellen. Hoewel de algoritmen verschillende biofysische stimuli als uitgangspunt hadden, bleken alle in staat om normale botheling te voorspellen (Hoofdstuk 3). Als validatie werden ze vervolgens gebruikt om een specifiek dierexperiment te simuleren waarin een botfractuur belast werd met axiale compressie of torsie. Geen van de algoritmen bleek in staat om de experimenteel waargenomen verdeling van weefseltypen correct te voorspellen. De beste resultaten werden verkregen met een algoritme waarin weefseldifferentiatie gestuurd werd door deviatorische rek en vloeistofstroming (Hoofdstuk 4). Verder onderzoek naar dit algoritme bracht aan het licht dat dit algoritme ook de verdeling van weefsels tijdens diverse stadia van distractie osteogenese kon voorspellen als rekening werd gehouden met de groei van individuele weefseltypen. Ook veranderingen in het distractie osteogenese proces bij andere distractiesnelheden of -frequenties werden met dit model goed voorspeld (Hoofdstuk 5).

In het tweede deel van deze studie werd een nieuw mechanistisch model voor cel activiteit ontwikkeld waarmee veel tekortkomingen van de eerdere modellen konden worden opgelost. In dit model werd het celfenotype gestuurd door mechanische factoren, en was de activiteit en snelheid waarmee een weefsel zich ontwikkelt weefselspecifiek. Dit model kon, net als de voorgaande modellen, normale fractuurheling simuleren. Daarnaast kon het ook vertraagde of onvolledige botheling als gevolg van excessieve belasting of biologische verstoringen en pathologische condities voorspellen. Ook veranderingen in het helingsproces na verwijdering van het periosteum of bij verstoring van het mineralisatie proces van kraakbeen kwamen overeen met experimentele data (Hoofdstuk 6). Dit nieuwe model bevat een groot aantal parameters waarvan de meeste uit de literatuur zijn gehaald. Voor een aantal parameters kon echter geen betrouwbare waarde bepaald worden. Met de zogenaamde ‘design of experiments’-methode in combinatie met een Taguchi orthogonale matrix analyse was mogelijk om die modelparameters te identificeren die de meeste invloed hebben op het bothelingsproces. Deze parameters bleken direct gerelateerd aan botformatie en aan kraakbeensynthese en -degradatie, hetgeen goed overeenkomt met in de biologie gehanteerde concepten. Parameters die invloed hebben op bindweefsel en kraakbeenvorming hadden een sterk niet-lineair effect op de resultaten met begrensde optima. Deze resultaten geven aan dat afwijkingen van de optimale waarden de botheling sterk en negatief kunnen beïnvloeden (Hoofdstuk 7).

Het laatste deel van deze studie was gericht op de remodelleringfase van botheling. Een experiment toonde aan dat bij muizen een dubbele cortex ontstaat in een laat stadium van fractuurheling. Dit tot nu toe onbekende karakteristieke fenomeen werd succesvol gereproduceerd met een simulatiemodel voor botremodellering. De simulaties toonden aan dat dit remodelleringsgedrag een gevolg is van een afwijkende gewrichtsbelasting bij kleine zoogdieren zoals muizen, veroorzaakt door de specifieke stand van gewrichten (Hoofdstuk 8).

Samenvattend heeft dit onderzoeksproject bevestigd dat mechanobiologische numerieke modellen leiden tot een beter begrip van cel- en weefseldifferentiatie tijdens fractuurheling en distractie osteogenese. De studies in dit proefschrift zetten belangrijke stappen naar de ontwikkeling van meer mechanistische modellen van cel- en weefseldifferentiatie en de validatie daarvan. Het ligt in de verwachting dat deze modellen kunnen helpen bij het screenen van potentiële behandelprotocollen voor verschillende vormen van pathofysiologische fractuurheling