Enzymatic collagen cross-links are fundamental to the mechanical integrity of collagen fibrils, which provide stability and form to most tissues and organs. During aging however, deleterious collagen modifications lead to the formation of additional cross-links, so called advanced glycation end-products (AGE), which inhibit proper tissue function and lead to pathological stiffness. Furthermore, glycosaminoglycans (GAG) of the small leucine-rich proteoglycans, decorin and biglycan, have been increasingly posited to contribute to tensile mechanical behavior of collagenous tissues. It has been suggested that they act as molecular cross-links between discontinuous collagen fibrils. In addition to these endogenous types of cross-links, chemical cross-linking has long been employed to augment the mechanical stability of collagen based implants for the replacement of musculoskeletal and cardiovascular tissues. This body of work examines the mechanical implication of all of these cross-links.

The first goal of the present doctoral thesis was to investigate the influence of age-related cross-linking on tendon mechanics from the molecule to the whole tissue. Secondly, it was investigated whether a degradation of endogenous GAG cross-links affects tissue mechanics. Thirdly, it was investigated whether the application of exogenous cross-links holds potential in augmenting remaining intact regions of a tendon injury and restore more normal function.

To investigate age-related cross-links, methylglyoxal, a metabolite responsible for AGE formation, was used to develop a reliable rat tail tendon-AGE model. Owing to the relatively straightforward hierarchical organization of rat tail tendons, they served as model to investigate collagen structure and function. The developed in vitro tendon-AGE model showed the typical correlates of AGE formation like increasing collagen fluorescence, denatruation temperature, and tissue strength. Tendon stretching on the stage of a multiphoton confocal microscope revealed a drastic reduction of viscoelasticity, with underlying reductions of collagen fiber shear and sliding. The following investigation of collagen fibril deformation by use of synchrotron small-angel X-ray scattering demonstrated that cross-linking reduced molecular sliding, resulting in stronger, less viscoelastic and more brittle collagen fibrils.

Next, chondroitinase ABC, which degrades GAGs from decorin and biglycan, was used to quantify the contribution of GAGs to tendon mechanics. Statistical tests for equivalence confirmed equal stiffness between GAG depleted tendon and their native controls, within limits that were conservatively based on predictions from an ultra-structural finite element model. Collagen fibril stiffness remained equally unaffected by the treatment as measured by small-angel X-ray scattering, while spectrophotometric assays and transmission electron microscopy indicated a nearly complete GAG degradation by chondroitinase ABC. Although, treatment associated tissue swelling was controlled by polyethylene glycol in the test environment, a dynamic mechanical analysis and stress relaxation indicated small shifts to more viscous tissue properties due GAG degradation.

Finally, the feasibility of arresting mechanical damage by introducing exogenous cross-linkers in a relevant, large animal tendon-injury model was tested using high cycle fatigue. We used genipin a natural fruit derived compound, since a range of screening experiments indicated superior ability in augmenting tendon mechanics compared to for example physical cross-linking methods. Following these successful screening experiments, we established an in vitro dose-response baseline of the genipin treatment on cells and their matrix. Crosslinking penetration and cytotoxicity seemed to be mainly dependent on the concentration and to a lesser extent on time. Using probit regression models, it was further demonstrated that functional relevant cross-linking assessed by differential scanning calorimetry and mechanical testing, cannot be achieved without some adverse consequences on cell viability and metabolic activity.

Enzymatische Kollagenvernetzungen sind wesentlich für die mechanische Stabilität von Kollagenfibrillen zuständig und tragen damit zum Widerstandsvermögen und zur Form der meisten Gewebe und Organe bei. Während des Alterns führen schädliche Veränderungen an den Aminosäuren von Kollagen zur Bildung von zusätzlichen Quervernetzungen. Diese sogenannten fortgeschrittenen Glykierungsendprodukte werden in der Fachsprache als "Advanced Glycation End-Products" (AGE) bezeichnet. AGE hemmen eine normale Gewebefunktion und führen zu Gewebesteifigkeit. Neben den AGE werden auch die Glykosaminoglykane (GAG) der Proteoglykane Decorin und Biglycan als mögliche Quervernetzungen von Kollagenfasern gehandelt, die wiederum auch zum Widerstandsvermögen von Geweben beitragen würden. Im Gegensatz zu diesen endogenen Vernetzungen werden exogene Vernetzungen zur Stabilisierung von kollagenbasierten Biomaterialien eingesetzt:​ zum Beispiel bei Implantaten für den Bewegungsapparat oder das Herz-Kreislauf-System. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der Einfluss dieser drei Typen Quervernetzungen auf die Mechanik von Sehnen, beziehungsweise von Kollagen, untersucht.

Der Metabolit Methylglyoxal wurde genutzt, um AGE im Kollagen von Sehnen zu bilden. Dieses Sehnen-AGE Modell zeigte Ähnlichkeit zur in vivo AGEBildung, wie erhöhte Kollagen Fluoreszenz und Schmelztemperatur, erhöhte Bruchfestigkeit und Steifigkeit der Sehnen. Diese Sehnen wurden anschliessend auf einem Multiphotonenmikroskop mechanisch getestet. Dabei wurde eine starke Reduktion von Scherbewegungen der Kollagenfasern beobachtet, was den Verlust von Viskoelastizität des Gewebes erklärt. Zusätzlich zeigte eine Untersuchung mittels Synchrotron Kleinwinkel-Röntgenstreuung eine Verminderung der molekularen Scherbewegungen, was in erhöhte Stärke und Sprödheit der Kollagenfibrillen resultierte.

Um die Auswirkungen der GAG von Decorin und Biglycan auf die Viskoelastizität von Sehnen zu untersuchen, wurden mechanisch Versuche mit normalen Sehnen sowie Sehnen nach enzymatischer GAG-Verdauung durchgeführt. Spektrophotometrische Methoden und Transmissionselektronenmikroskopie zeigten eine fast komplette enzymatische GAG-Verdauung. Mithilfe eines strukturähnlichen Finite-Elemente Modells und statistischer Methoden der Äquivalenz wurde aber die Gleichheit der quasi-statischen mechanischen Eigenschaften von Kontrollsehnen und GAG verdauten Sehnen gezeigt. Auch die Untersuchung der zwei Gruppen mittels Kleinwinkel-Röntgenstreuung zeigte keine Unterschiede in der Kollagensteifigkeit. Relaxationsexperimente und eine dynamisch-mechanische Analyse deckten aber eine leichte Erhöhung der Gewebeviskosität nach enzymatischer GAG-Verdauung auf.

Mit einer Reihe von Vorversuchen wurden die Auswirkungen verschiedener exogener, physikalischer und chemischer Methoden der Quervernetzung auf die mechanischen Eigenschaften von Sehnen untersucht. Es zeigte es sich, dass Genipin, eine natürliche chemische Verbindung, die stärkste mechanische Stabilisierung hervorruft. Daher wurde Genipin benutzt, um künstlich hervorgerufene Verletztungen in Sehnen zu stabilisieren. Mit Ermüdungsversuchen wurde diese Stabilisierung anschliessend demonstriert. Die Zytotoxizität dieser experimentalen Behandlung von Verletzungen wurde mithilfe von DosisWirkungs-Kurven beschrieben. Dynamische Differenzkalorimetrie und weitere mechanische Experimente zeigten aber, dass eine mechanische Stabilisierung nur unter Einschränkung der Lebensfähigkeit der Sehnenzellen erreicht werden kann