Bone is a fascinating material which is able to functionally adapt to mechanical demands by remodeling itself. Discussions about bone health and disease typically revolve around increased bone fracture risk and strategies aimed at mitigation or prevention of such fractures. Animal models, particularly mice, have played a significant role in advancing bone disease research, elucidating phenomena such as the influence of local mechanical stimuli on bone remodeling, known as mechanoregulation. They have been crucial in the advancement of pharmaceutical treatments of osteoporosis, a prevalent bone disease characterized by decreased bone mass, particularly affecting the elderly population. However, for some diseases such as osteogenesis imperfecta (OI), a rare heterogeneous genetic disorder characterized by increased bone fragility and deformities, animal models reach their limitations. In vitro bone models are an emerging technology for understanding disease mechanisms and developing targeted therapies. Using micro-computed tomography (micro-CT) has enabled a range of non-destructive image-based analyses in vivo such as investigating mineralization dynamics or mechanoregulation using microfinite element (micro-FE) models based on these images. Tailoring such methods to in vitro approaches will lead to additional insights from bone tissue engineering and may enable advances in the development and optimization of in vitro bone models.
The address these gaps, the present thesis has been divided into three aims: (i) developing a volumetric method to analyze mechanoregulation in in vitro bone scaffolds, (ii) analyze tissue mineralization and mechanoregulation in a FKBP10-related OI organotypic bone model, and (iii) investigate the influence of osteoporosis treatments on mechanoregulation in vivo.
To address the first aim of the thesis, we aimed at developing and implementing a volumetric method for quantifying mechanoregulation of bone formation in tissue-engineered constructs, utilizing micro-CT images and micro-FE analysis. We first established a conversion function correlating tissue mineral density and Young’s modulus for in vitro applications, enabling microFE modelling in bone tissue engineering. Secondly, we examined hydroxyapatite scaffolds seeded with human mesenchymal stem cells, incubated over 8 weeks with one mechanically loaded and a control group from a previous study. Significantly higher mechanoregulation of bone formation was observed in the loaded samples compared to non-loaded controls during culture in osteogenic medium. Subsequently, the volumetric method was applied to an in vivo mouse study investigating the effect of loading frequencies on bone adaptation, exploring the applicability for in vivo studies. Differences in mechanoregulation of bone formation between loading conditions were detected. Mechanoregulation in bone formation was more pronounced when calculated with the volumetric method compared to the previously used surface-based method.
In the second part of the thesis, we used and extended computational methods to investigate tissue mineralization in an organotypic bone model for FKBP10-related OI. First, we created mechanically loaded 3D-bioprinted patient-specific organotypic bone models for FKBP10-related OI and healthy controls from patient derived osteoblasts. Using time-lapsed micro-CT, hypermineralization was observed in FKBP10-related OI samples compared to healthy controls. Additionally, we observed a decoupling of tissue mineral density and experimental stiffness in OI samples. Employing sample-specific micro-FE analysis allowed us to replicate experimental stiffness, and to detect similar extents of mechanoregulation in both FKBP10-related OI organotypic bone models and healthy controls. Regional analysis revealed heterogeneous mineralization, microarchitectural irregularities, and scaffold microporosity in OI samples. Our findings suggest that the dysregulated mineralization observed is a primary contributor to the altered mineral-mechanical properties observed in FKBP10-related organotypic bone models, whereas mechanoregulation appears to be consistent with that of healthy controls.
To address the third aim of the thesis, we investigated the effects of combining mechanical loading with pharmaceutical treatments (bisphosphonates, parathyroid hormone, or sclerostin antibodies) on mechanoregulation in trabecular bone in ovariectomized C57Bl/6J mice. Mechanical loading synergistically enhanced trabecular bone mass under parathyroid hormone or sclerostin antibody therapy. Mechanoregulation analysis revealed bone (re)modeling was targeted to mechanical demands in all physical and pharmaceutical treatments, albeit to varying degrees. Bisphosphonate treatment decreased sensitivity of mechanoregulation compared to anabolic treatments, which could not be recovered by mechanical loading. Mechanical loading enhanced the mechanoregulatory response of sclerostin antibody treatment and parathyroid hormone treatment, suggesting that incorporating physical therapy into anabolic pharmaceutical regimens may improve therapeutic outcomes in osteoporosis management.
In summary, this thesis explored two key areas in bone research: mechanoregulation and mineralization in tissue-engineered bone constructs, and the influence of combination therapies on mechanoregulation for postmenopausal osteoporosis. Firstly, we quantified mechanoregulation of bone formation in tissue engineered bone constructs. Secondly, we analyzed mineralization dynamics and mechanoregulation in organotypic bone models of OI, shedding light on how dysregulated mineralization impairs stiffness. Finally, we demonstrated that combining mechanical loading and anabolic pharmaceutical treatments in a mouse model of osteoporosis can increase therapy efficacy and decrease fracture risk.
Ultimately, we have shown that by tailoring computational methods to in vitro applications, we can fully leverage non-destructive image-based analyses to maximize research insights. Our results highlight the importance of mechanoregulation in vitro and in vivo and suggest that in the future more resources should be dedicated to understanding the potential of physical therapy in bone disease management.
Knochen sind ein faszinierendes Organ, das in der Lage ist, sich funktionell an mechanische Anforderungen anzupassen, indem es sich selbst umbaut. Wenn von Knochengesundheit und - krankheiten die Rede ist, geht es in der Regel um ein erhöhtes Risiko für Knochenbrüche und deren Verhinderung. Viele Fortschritte in der Erforschung von Knochengesundheit und -krankheiten wurden mit Hilfe von Tiermodellen wie Mäusen erzielt, z. B. dass lokale mechanische Reize den Knochenumbau beeinflussen, ein Prozess, der Mechanoregulation genannt wird. Sie waren entscheidend für die Weiterentwicklung der pharmazeutischen Behandlung von Osteoporose, einer weit verbreiteten Knochenkrankheit, die durch eine verminderte Knochenmasse gekennzeichnet ist und vor allem die ältere Bevölkerung betrifft. Bei einigen Krankheiten wie der Osteogenesis imperfecta (OI), einer seltenen heterogenen genetischen Störung, die durch eine erhöhte Knochenbrüchigkeit und Deformationen der Knochen gekennzeichnet ist, stoßen Tiermodelle jedoch an ihre Grenzen. In vitro Modelle sind eine aufkommende Technologie, um Krankheitsmechanismen zu verstehen und gezielte Therapien zu entwickeln. Der Einsatz von Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) hat eine Reihe zerstörungsfreier bildbasierter Analysen in vivo ermöglicht, wie z. B. die Untersuchung von Mineralisierung oder der Mechanoregulation mit Hilfe von Mikro-Finite-Elemente-Modellen (Mikro-FE). Die Anpassung solcher Methoden für Tissue Engineering von Knochen könnte zu zusätzlichen Erkenntnissen aus in vitro Studien führen und Fortschritte bei der Entwicklung und Optimierung von in vitro Knochenmodellen ermöglichen.
Die vorliegende Arbeit gliedert sich in drei Ziele: (i) Entwicklung einer volumetrischen Methode zur Analyse der Mechanoregulation in in vitro Knochenmodellen, (ii) Analyse der Mineralisierung und der Mechanoregulation in einem FKBP10-OI organotypischen Knochenmodell und (iii) Untersuchung des Einflusses von Osteoporosetherapien auf die Mechanoregulation in vivo.
Um das erste Ziel der Arbeit zu erreichen, wollten wir eine volumetrische Methode zur Quantifizierung der Mechanoregulation der Knochenbildung in in vitro Knochen zu entwickeln und implementieren, wobei wir Mikro-CT-Bilder und Mikro-FE-Analysen verwendeten. Wir haben zunächst eine Funktion entwickelt, die die Mineraldichte und den Elastizitätsmodul für in vitro Anwendungen korreliert und so die Modellierung von Mikro-FE im Tissue Engineering für Knochen ermöglicht. Dazu untersuchten wir mit humanen mesenchymalen Stammzellen besetzte Hydroxylapatit Scaffolds aus einer früheren Studie, die für 8 Wochen inkubiert wurden. Eine Gruppe wurde regelmässig mechanisch belastetet und eine es gab eine zweite statische Gruppe zur Kontrolle. Bei den belasteten Proben wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe während der Kultur in osteogenem Medium eine signifikant höhere Mechanoregulation der Knochenbildung beobachtet. Anschließend wurde die Methode in einer in vivo Studie an Mäusen angewandt, in der die Auswirkung von Belastungsfrequenzen auf die Knochenanpassung untersucht wurde. Zum einen konnten Unterschiede in der Mechanoregulation der Knochenbildung unter verschiedenen Belastungsbedingungen festgestellt werden. Zum anderen war die mit der volumetrischen Methode festgestellte Mechanoregulation der Knochenbildung im Vergleich zur oberflächenbasierten Methode stärker ausgeprägt.
Im zweiten Teil der Arbeit haben wir computergestützte Methoden eingesetzt und erweitert, um die Mineralisierung in einem organotypischen Knochenmodell für FKBP10-OI zu untersuchen. Zunächst haben wir mechanisch belastete, 3D-gedruckte, patientenspezifische organotypische Knochenmodelle für FKBP10-OI und gesunde Kontrollen mit Hilfe von Patienten-spezifischen Osteoblasten hergestellt. Mit Hilfe von wöchentlichem Mikro-CT wurde bei FKBP10-OI Modellen im Vergleich zu gesunden Kontrollen eine Hypermineralisierung festgestellt. Darüber hinaus beobachteten wir in OI Scaffolds eine Entkopplung von Knochenmineraldichte und experimenteller Steifigkeit. Mit Hilfe modellspezifischer Mikro-FE-Analysen konnten wir die experimentelle Steifigkeit replizieren und eine ähnliche Mechanoregulation in organotypischen Knochenmodellen mit FKBP10-OI und in gesunden Kontrollmodellen feststellen. Eine regionale Analyse der Mikro-CT-Bilder zeigten eine heterogene Mineralisierung, mikroarchitektonische Unregelmäßigkeiten und Mikroporosität in OI Modellen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die beobachtete dysregulierte Mineralisierung in erster Linie zu den veränderten mechanischen Eigenschaften beiträgt, die in FKBP10-OI organotypischen Knochenmodellen beobachtet wurden, während die Mechanoregulation mit denen der gesunden Knochenmodellen übereinzustimmen scheint.
Um das dritte Ziel dieser Arbeit zu erreichen, untersuchten wir die Auswirkungen einer Kombination aus mechanischer Belastung und pharmazeutischer Behandlung (Bisphosphonate, Parathormon oder Sklerostin-Antikörper) auf die Mechanoregulation im trabekulären Knochen von ovariektomierten C57Bl/6J-Mäusen. Mechanische Belastung erhöhte die trabekuläre Knochenmasse unter Parathormon- (additiv) oder Sklerostin-Antikörpertherapie (synergistisch). Die Analyse der Mechanoregulation ergab, dass der Knochenumbau bei allen Therapien auf die mechanischen Anforderungen angepasst war, aber in unterschiedlichem Maße. Die Bisphosphonatbehandlung verringerte die Mechanosensitivität im Vergleich zu anabolen Behandlungen, was durch mechanische Belastung nicht wieder ausgeglichen werden konnte. Mechanische Belastung verstärkte die mechanoregulatorische Reaktion auf die Behandlung mit Sklerostin-Antikörpern und Parathormon, was darauf hindeutet, dass die Einbeziehung von Physiotherapie in anabole pharmazeutische Behandlungen die therapeutischen Ergebnisse bei der Behandlung von Osteoporose verbessern könnte.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei Schlüsselbereiche der Knochenforschung untersucht: Mechanoregulation und Mineralisierung in gewebegeformten Knochenkonstrukten und der Einfluss von Kombinationstherapien auf die Mechanoregulation bei postmenopausaler Osteoporose. Erstens konnten wir die Mechanoregulation der Knochenbildung in in vitro Knochenmodellen quantifizieren. Zweitens haben wir die Mineralisierungsdynamik und die Mechanoregulation in organotypischen Knochenmodellen mit OI analysiert und beleuchtet, wie eine dysregulierte Mineralisierung die Steifigkeit beeinträchtigt. Schließlich haben wir gezeigt, dass die Kombination von mechanischer Belastung und anaboler pharmazeutischer Behandlung in einem Mausmodell für Osteoporose die Wirksamkeit der Therapie erhöhen und das Frakturrisiko senken kann.
Insgesamt haben wir demonstriert, dass wir durch die Anpassung von in silico Methoden für in vitro Anwendungen die zerstörungsfreie bildbasierte Analyse voll ausschöpfen können, um die Forschungserkenntnisse und -ergebnisse zu maximieren. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Mechanoregulation und legen nahe, dass in Zukunft mehr Ressourcen für die Erforschung und das bessere Verständnis des Potenzials der Physiotherapie bei der Behandlung von Knochenerkrankungen eingesetzt werden sollten.