Tissue reconstruction aims to rebuild a functional tissue in vitro by seeding cells on a three-dimensional (3D) scaffold with the goal to replace damaged tissue or use the engineered tissue as substrate for drug development in vitro. Current limitations in the conventional tissue reconstruction approach include the lack of geometry control in scaffold fabrication and limited possibilities to implement vascular systems. The process of cell seeding is another critical factor which, since it is mostly performed by hand, limits the controlled placement of cells at specific locations in the scaffold and the usage of different cell types in a certain pattern.

3D bioprinting builds up biological material layer-by-layer generating a stable 3D tissue construct. Most bioprinters contain several cartridges which allow to print predefined 3D patterns consisting of different bioinks. They can be used to explore for example the generation of complex bone tissue concomitantly with vascular structures. The bioink can be enhanced with different components such as cells or inorganic minerals, providing a great basis for their spatially-directed placement. If cells are included they should be embedded in a suitable bioink which preserve cells at best from harsh printing conditions such as high shear stresses and allows solidification with gentle crosslinking conditions. 3D bioprinting has the potential to overcome the limitations concerning uncontrolled cell placement and unstructured scaffold geometries. 3D bioprinting is still at the beginning and there are only few materials available which allow the gentle deposition of biomaterials including living cells and generate a stable 3D structure after printing at the same time.

The aim of this doctoral thesis was to generate multicellular skeletal tissues with 3D bioprinting which mimic the natural tissue to a high degree and address some of the current limitations in tissue reconstruction. The thesis was divided into three main aims:​ (i) establishment and validation of a 3D bioprinter in combination with the development and characterization of a suitable bioink, (ii) bioprinting of multiphase constructs containing channels with a focus on geometry and interface characterization and (iii) the application of the printed constructs for bone tissue engineering.

In a first step, a printer had to be selected and modified in hard- and software to be able to carry out the goals defined in this thesis. The printer was required to print cells and matrix together in predefined locations of 3D patterns such that the cells survive the printing process and further culture. The bioink must be printable and protect the embedded cells during the printing process. A stable 3D geometry was achieved with a cell-compatible solidification process. Materials which allow a combined cell and matrix printing are hydrogels. A new hydrogel composite consisting of alginate and gelatin enhanced with different amounts of hydroxyapatite was developed. Alginate is one of the most favorable hydrogels for cell-based bioprinting and can be irreversibly crosslinked with calcium ions. Gelatin enhances cell attachment and is temperature-dependent;​ it can be solidified instantaneously with a temperature-drop in a range where it is not harmful to cells. Hydroxyapatite was added due to its osteoinductive character and to serve as contrast agent for micro-computed tomography (µCT) analysis. We chose this two-step crosslinking procedure because it enabled instantaneous stability of the printed filaments via cooling of gelatin and long-term stability of the construct by crosslinking alginate after the whole construct was printed. The composites were analyzed regarding rheology, swelling behavior and mechanical properties. Interestingly, adding different amounts of hydroxyapatite did not significantly alter material characteristics of the composite. Printing parameters had to be adapted to each bioink to enable proper printing of the desired geometries. To characterize individual printed filaments, spirals were printed in a single printing plane. 3D bulk constructs printed of several layers served to confirm cell viability of embedded human mesenchymal stem cells (hMSCs) 3 days after printing. Multiphase printing was proven by printing channels of a secondary phase within a hydrogel bulk, as the primary phase.

Printing filled and hollow channels within 3D bulk constructs were addressed in the second part of this thesis. Hollow channels can be used as basis for vascular systems promoting nutrient- and oxygen supply as well as waste removal. This is especially important for larger constructs in clinically relevant sizes, where the supply is not sufficient via diffusion only. Another application is nerve regeneration where channels filled with a stimulative environment can guide newly forming nerves in direction and length. Several aspects were investigated on the basis of channels in a 3D bulk material:​ different procedures to generate printing scripts, the smallest possible printing resolution and feature size for the generation of channels in horizontal and vertical orientation, more complex channel geometries, the interface between two phases and the influence of additional cells in the bioink on the printing process and the resulting construct. With the application of coordinate-based printing scripts - compared to automated printing scripts - smaller and more accurate channels could be printed on predefined locations. The smallest printing resolution was influenced by printing parameters, structure orientation, geometry and the used bioink. The smallest resolution for printing cell-compatible alginate-gelatin channels in horizontal orientation was 500 µm and for channels in vertical orientation 1 mm. The interface analysis revealed a clear separation between different phases;​ however the phases were physically connected through the crosslinking of alginate. Embedded cells in the bioink showed a homogeneous cell distribution within their phase and did not change size and shape of the printed channels. Hollow channels were successfully generated with different sizes via the release of a support material, which was gelatin in this study.

In the last part of the thesis, the behavior of hMSCs embedded in the new alginategelatin-hydroxyapatite composite was investigated regarding cell metabolic activity, the potential to differentiate along the osteogenic lineage and to produce mineralized extracellular matrix. Cell metabolic activity of the cell-containing hydrogel discs was analyzed with respect to hydrogel composition and crosslinking time. The amount of hydroxyapatite as well as crosslinking time did not show an influence on cell metabolic activity over 1 week in vitro. Constructs in pure culture medium revealed a weakening of their structure over time. To counteract this degradation, cell-containing hydrogel discs were cultured in control medium additionally enhanced with a low concentration of crosslinking ions. In this case, the integrity of the constructs could be maintained, but cell metabolic activity decreased over 4 weeks in vitro. This indicated a negative influence of the alginate crosslinking reagent calcium chloride (CaCl₂) on cell metabolic activity. Printed 3D alginate-gelatin-hydroxyapatite hydrogel constructs with embedded hMSCs were also cultured in osteogenic medium to investigate the osteogenic potential of the biofabricated constructs. Cell metabolic activity, osteogenic differentiation and mineralization were investigated during a 4 week in vitro culture. Cell metabolic activity decreased over time, while alkaline phosphatase activity - indicating osteogenic differentiation - increased. This effect was enhanced for the samples cultured in osteogenic environment and even more with higher amounts of hydroxyapatite. Since no difference in mineral density was found between the cell-containing and cell-free samples, it was assumed that the mineralization was based on the detected initial mineral density of the constructs plus spontaneous mineralization. The osteogenic environment prevented spontaneous mineralization of the constructs - no mineralized clusters were visible after 4 weeks in osteogenic medium compared to distinct mineralized clusters on constructs in control medium. CaCl₂ in the culture medium used to improve construct stability needs to be investigated more in detail. Also, additional treatments and/or biological signals such as bone morphogenetic protein or transforming growth factors β could help to improve cell metabolic activity and induce cell stimulation to produce extracellular matrix.

In conclusion, with the 3D bioprinting system developed in this thesis, stable 3D multiphase hydrogel constructs including living cells were successfully generated, with the cells surviving the printing process. Filled and hollow channels could be printed in predefined locations within bulk material. Cells remained in their respective phase homogeneously distributed and the different phases were physically connected. Parameters which influence the feature size in filament-based printing were systematically analyzed and applied to achieve the smallest possible structures with this setup. Further development of the bioink and culture conditions is needed to improve longer-term cell metabolic activity and especially functionality for the application of reconstructed tissues. 3D bioprinting permits a more detailed tissue composition compared to tissues fabricated with conventional methods and thus a more sophisticated basis for tissue reconstruction. The discipline is still at the beginning but is intensively investigated nowadays to address some of the current limitations in tissue reconstruction such as irregular scaffold architecture or uncontrolled cell seeding. In the framework of this thesis we developed a method where more complex multiphase geometries could be successfully printed providing a controlled cell placement and a homogeneous cell distribution within the respective phases. The ink is the most limiting factor in the process at the moment;​ there are only few suitable materials available due to the many restrictions regarding printability, construct stability and cell viability during printing and in longer-term. With the alginate-gelatin-hydroxyapatite hydrogel developed in this thesis we contributed a valuable composite to the collection of suitable bioinks.

Die Geweberekonstruktion beruht auf dem Aufbau von funktionalem Gewebe im Labor durch Besiedeln von dreidimensionalen Gerüsten - sogenannten Scaffolds - mit Zellen. Das Ziel ist, mit diesem rekonstruierten Gewebe beschädigtes Gewebe ersetzen zu können oder es als Grundlage für Medikamentenentwicklung im Labor zu verwenden. Aktuelle Einschränkungen beim herkömmlichen Gewebeaufbau sind die fehlende Kontrolle über die Geometrie bei der Scaffoldherstellung und die begrenzten Möglichkeiten, vaskuläre Systeme zu implementieren. Ein weiterer kritischer Punkt ist das Besiedeln mit Zellen, das meistens noch per Hand durchgeführt wird. Dadurch lassen sich Zellen nur bedingt an spezifische Orte im Scaffold platzieren, was zur Folge hat, dass verschiedene Zelltypen nur ungenau nach vorgegebenen Mustern angeordnet werden können. Mit dem dreidimensionalen Biodrucker werden biologische Materialien schichtweise aufeinander aufgebaut, um eine stabile dreidimensionale Gewebekonstruktion zu erzeugen. Die meisten Biodrucker sind mit mehreren Kartuschen ausgestattet und ermöglichen das Drucken von vordefinierten dreidimensionalen Strukturen mit mehreren Phasen. Sie können zum Beispiel verwendet werden um das Drucken von Knochengewebe einschliesslich vaskulärer Strukturen zu erforschen. Die Biotinte kann mit biologischen Substanzen, wie beispielsweise Zellen, Proteinen oder Wachstumsfaktoren angereichert werden und bietet damit eine bedeutende Grundlage für das räumlich gerichtete Platzieren dieser Substanzen. Zellen werden in die Biotinte eingeschlossen um sie vor rauen Bedingungen während des Druckvorgangs, wie zum Beispiel hohen Scherkräften, zu schützen. Die Biotinte muss ausserdem mit einem zellfreundlichen Prozess verfestigt werden können. Das dreidimensionale Drucken biologischer Gewebe bietet eine ausgezeichnete Möglichkeit, um Einschränkungen beim unkontrollierten Besiedeln mit Zellen und unstrukturierte Scaffoldgeometrien zu überwinden. Das dreidimensionale Biodrucken steckt immer noch in den Kinderschuhen und es stehen erst wenige Materialien zur Verfügung, die schonendes Drucken von Biomaterialien mit lebenden Zellen zulassen und gleichzeitig zu einer stabilen dreidimensionalen Struktur nach dem Drucken führen.

Ziel dieser Doktorarbeit war es, mit einem neuen Biodrucker multizelluläre skelettartige Gewebe naturgetreuer nachzubauen als es mit herkömmlichen Verfahren möglich ist und somit manche aktuelle Einschränkungen in der Geweberekonstruktion ein Stück weit zu überwinden. Die Arbeit wurde in drei Hauptziele aufgeteilt:​ (i) Aufbau und Validierung des dreidimensionalen Biodruckers in Kombination mit der Entwicklung und Charakterisierung einer geeigneten Biotinte, (ii) biologisches Drucken von mehrphasigen Gebilden mit Kanälen mit Schwerpunkt auf der Charakterisierung der Geometrie und der Grenzflächen zwischen den Phasen und (iii) Verwendung der gedruckten Gewebe im Tissue Engineering von Knochen.

In einem ersten Schritt wurde der Drucker ausgewählt und bezüglich Hard- und Software angepasst, um die in der Arbeit definierten Ziele verwirklichen zu können. Der neue Mehrphasendrucker sollte Zellen und Matrix zusammen in vorgegebene Positionen innerhalb dreidimensionaler Geometrien platzieren, sodass die Zellen den Druckprozess und die darauffolgende Kultur überleben. Die Biotinte musste druckfähig sein und die eingebetteten Zellen während des Druckprozesses schützen. Eine stabile dreidimensionale Matrix konnte mit einem zellkompatiblen Gelierprozess erreicht werden. Materialien, welche ein gemeinsames Drucken von Zellen und Matrix erlauben, sind Hydrogele. Ein neuer Hydrogelverbundstoff wurde entwickelt, der auf Basis von Alginat und Gelatine mit unterschiedlichen Mengen an Hydroxylapatit angereichert wurde. Alginat ist eines der vorteilhaftesten Hydrogele für zellbasiertes Drucken und kann mit Kalziumionen irreversibel vernetzt werden. Gelatine fördert die Anhaftung von Zellen und ist temperaturabhängig;​ die sofortige Gelierung kann durch eine Absenkung der Temperatur in einem für Zellen unschädlichen Temperaturbereich herbeigeführt werden. Hydroxylapatit wurde wegen der knochenfördernden Eigenschaften und als Kontrastmittel für Mikro-Computertomographie (µCT) beigegeben. Wir wählten das zweistufige Gelierungsverfahren da die sofortige Stabilität der gedruckten Stränge durch Kühlen der Gelatine und die Langzeitstabilität des Gebildes durch Vernetzen von Alginat im Anschluss an den Druckprozess erreicht werden konnte. Die Verbundstoffe wurden bezüglich Rheologie, Schwellverhalten und mechanischen Eigenschaften untersucht. Interessanterweise haben die unterschiedlich hinzugefügten Mengen an Hydroxylapatit die Materialeigenschaften des Verbundstoffes nicht wesentlich verändert. Kenngrössen, die zum Drucken verwendet wurden, mussten an jede Biotinte angepasst werden, um ein korrektes Drucken der erwünschten Geometrien zu ermöglichen. Um einzelne gedruckte Stränge untersuchen zu können, wurden Spiralen in einer Schichtebene gedruckt. Dreidimensionale Gebilde, die aus mehreren Schichten aufgebaut wurden, dienten zur Analyse von Zellviabilität der eingebundenen humanen Mesenchymalen Stammzellen (hMSZ) nach 3 Tagen. Durch Drucken von Kanälen in ein Hydrogelgebilde wurde gezeigt dass Mehrphasendrucken möglich ist.

Das Drucken von gefüllten und hohlen Kanälen wurde im zweiten Teil der Arbeit angegangen. Die Herstellung von Kanälen, eingebettet in ein dreidimensionales Gebilde, ist für viele verschiedene Anwendungen interessant. Röhrenförmige Strukturen können als Grundlage vaskulärer Systeme zur Förderung von Nahrungs- und Sauerstoffzufuhr sowie zur Entsorgung von Abfallprodukten verwendet werden. Dies ist insbesondere für grössere Gebilde, welche auch klinisch relevant sind, wichtig, da die Versorgung einzig durch Diffusion bei Weitem nicht ausreicht. Eine weitere Anwendung ist die Nervenregenerierung, bei der mit einer stimulierenden Umgebung gefüllte Kanäle neu geformte Nerven in Richtung und Länge dirigieren können. Verschiedene Aspekte wurden, basierend auf Kanälen in dreidimensionalen Gebilden, untersucht:​ Unterschiedliche Verfahren zur Generierung des Druckcodes, die kleinstmögliche Strukturgrösse zum Drucken von horizontal und vertikal ausgerichteten Kanälen, komplexere Kanäle, Grenzflächen zwischen zwei Phasen und der Einfluss zusätzlich eingebetteter Zellen auf den Druckprozess und das fertige Gebilde. Mit koordinaten-basierenden Druckcodes - im Vergleich zu automatischen Druckcodes - konnten kleinere und präzisere Kanäle an vordefinierte Positionen gedruckt werden. Die kleinstmögliche Strukturgrösse wurde durch die zum Drucken verwendeten Kenngrössen, die Strukturausrichtung, die Geometrie und die Biotinte beeinflusst. Die kleinste Strukturgrösse, die mit dem zellkompatiblen Alginat-GelatineHydroxylapatit Hydrogel erreicht wurde, betrug 500 µm für horizontal ausgerichtete Kanäle und 1 mm für vertikal ausgerichtete Kanäle. Die Charakterisierung der Grenzflächen zeigte eine klare Trennung zwischen zwei unterschiedlichen Phasen, die jedoch physikalisch durch das Vernetzen von Alginat verbunden waren. Eingebettete Zellen waren homogen in ihrer Phase verteilt und hatten keinen Einfluss auf die Form und Grösse der Kanäle. Leere röhrenförmige Strukturen wurden erfolgreich durch Herauslösen eines Trägermaterials, Gelatine in dieser Studie, generiert.

Im letzten Teil der Arbeit wurde das Zellverhalten der hMSZ, eingebettet in der neuen Alginat-Gelatine-Hydroxylapatit-Biotinte, bezüglich Viabilität und ihres Potentials zur osteogenen Differenzierung sowie zum Produzieren extrazellulärer Matrix untersucht. Die Viabilität zellulärer Hydrogelgebilde wurde bezüglich der Hydrogelzusammensetzung und des Gelierprozesses analysiert. Die Zugabe von Hydroxylapatit sowie der Gelierprozess hatten keinen Einfluss auf die metabolische Aktivität der Zellen nach 1 Woche in vitro Kultur. Gebilde in reinem Kulturmedium wiesen mit der Zeit eine Schwächung der Struktur auf. Um diesem Abbau entgegenzuwirken wurden zelluläre Hydrogelgebilde in Kulturmedium kultiviert, welches zusätzlich mit niedrigkonzentriertem Kalzium angereichert wurde. Damit konnte die Integrität der Gebilde erhalten werden, jedoch nahm die Zellviabilität während eines Zeitraums von 4 Wochen in vitro ab. Dies deutet auf einen negativen Einfluss von Kaliziumchlorid (CaCl₂), welches benötigt wird um Alginat zu vernetzen, auf die Zellviabilität hin. Zum Schluss wurden mit der neuen Biotinte zelluläre Gewebe gedruckt und für Tissue Engineering von Knochen verwendet. Zellviabilität, osteogene Differenzierung und Mineralisierung der gedruckten Gewebe wurden während 4 Wochen in vitro untersucht. Die Zellviabilität nahm über die Zeit ab, während die Aktivität der alkalischen Phosphatase, ein osteogener Marker zur Indikation der osteogenen Differenzierung, zunahm. Dieser Effekt war verstärkt in den Gruppen mit osteogenem Medium und einem höheren Hydroxylapatit-Anteil sichtbar. Da kein Unterschied im Mineralgehalt zwischen den Zellgruppen und den zelllosen Gruppen festzustellen war, wurde vermutet, dass sich die gemessene Mineralisierung aus dem bekannten ursprünglichen Mineralgehalt der Gebilde und der spontanen Mineralisierung zusammensetzt. Die osteogene Umgebung verhinderte eine spontane Mineralisierung der Gebilde - nach 4 Wochen in osteogener Kultur war keine Anhäufung von Mineralisierung sichtbar, im Gegensatz zu einer ausgeprägten Mineralisierung der Kontrollgruppe. CaCl₂, welches zur verbesserten Stabilit¨t der Gebilde verwendet wurde, muss nochmals genauer untersucht werden. Zusätzliche Behandlungen und/oder biologische Substanzen wie beispielsweise Wachstumsfaktoren oder Transforming Growth Faktoren β können die Zellviabilität verbessern und die Zellen stimulieren damit sie extrazelluläre Matrix bilden.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass mit dem in dieser Arbeit entwickelten System zum dreidimensionalen Drucken biologischer Gewebe erfolgreich stabile dreidimensionale mehrphasige Gewebe mit eingebetteten lebenden Zellen aufgebaut werden konnten. Gefüllte Kanäle und leere röhrenförmige Strukturen konnten an spezifische vordefinierte Stellen in dreidimensionale Gebilde gedruckt werden. Die Zellen blieben in ihrer Phase jeweils homogen verteilt und die verschiedenen Phasen waren physikalisch miteinander verbunden. Kenngrössen, welche Einfluss auf die Strukturgrössen beim Drucken haben, wurden systematisch untersucht und so verwendet, dass kleinstmögliche Strukturen mit diesem Aufbau erzeugt werden konnte. Eine Weiterentwicklung der Biotinte und der Kulturbedingungen ist nötig um Zellviabilität und Funktionalität langfristig zu verbessern. Das dreidimensionale Drucken erlaubt den Aufbau einer detaillierteren Gewebekomposition verglichen mit herkömmlich gefertigten Geweben und bildet somit eine weiterentwickelte Basis zur Geweberekonstruktion. Das dreidimensionale Drucken ist noch eine junge Disziplin an der zur Zeit intensiv geforscht wird um manche der aktuellen Einschränkungen beim Gewebeaufbau, wie zum Beispiel unregelmässige Scaffold Geometrien oder unkontrolliertes Besiedeln mit Zellen, zu überwinden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, mit der erfolgreich komplexere mehrphasige Geometrien gedruckt und die Zellen gezielt platziert sowie homogen in der jeweiligen Phase verteilt werden konnte. Der Druckprozess ist heutzutage vor allem wegen der Tinte limitiert;​ durch die vielen Einschränkungen bezüglich Druckbarkeit, Stabilität der Struktur und Zellviabilität während und nach dem Drucken stehen erst wenige Materialien zur Verfügung. Mit dem Alginat-Gelatine-Hydroxylapatit Hydrogel, welches in dieser Arbeit entwickelt wurde, tragen wir ein weiteres Material auf diesem Gebiet bei.