Articular cartilage defects are a common pathology of cartilage that result from injury, trauma or wear and tear. If the defect is left untreated, the restoration of the cartilage surface is often not successfully achieved, possibly leading to the development of post-traumatic osteoarthritis (PTOA). When the disease reaches end-stage cartilage degeneration, the only possible treatment is total joint replacement, a procedure that is not optimal for younger patients due to the limited lifespan of the prosthesis. Cartilage has low cellularity, lacks vascularization and is known to have poor regenerative properties. The quiescent phenotype of chondrocytes and the local inflammation at the defect site hinder the regeneration of healthy, hyaline cartilage. The currently available treatments aim to avoid the onset of PTOA through restoration of the defect by stimulating the natural ability of bone marrow stem cells (BMSCs) to migrate and secrete cartilaginous matrix, as in microfracture, or providing chondrogenic cells at the defect site, as in autologous chondrocyte implantation (ACI). However, both techniques have limitations, such as high costs and the production of inferior quality cartilage that tends to degenerate over time. Alternative approaches that can provide better results and less severe negative consequences are thus needed.
With a combination of cells, hydrogels and signals, tissue engineering offers promising new tools for the treatment of cartilage defects. This combination is already in use in matrix-assisted autologous chondrocyte implantation (MACI), showing better results than other methods, but still relying on the use of poorly chondrogenic adult cells that are affected by inflammation. The use of juvenile polydactyly chondrocytes derived from young patients overcomes the limitation of poor chondrogenicity and the need for additional surgeries compared to autologous cell-based standard treatments. The advent of precise gene editing tools in recent years, such as the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 system, provides an additional exciting option for further utilising cell characteristics in regenerative medicine. This thesis aimed to develop a novel approach to treat cartilage defects by establishing an improved gene editing protocol for primary chondrocytes (Chapter 2), then identifying the optimal hydrogel composition for primary polydactyly chondrocytes (Appendix) and finally combining the findings to generate inflammation-resistant tissue-engineered cartilage for the repair of cartilage defects (Chapter 3).
Chapter 2 describes the gene editing protocol established to achieve high knockout (KO) levels in primary chondrocytes. Specifically, two delivery methods, lipid nanoparticle-based delivery and electroporation, were compared for delivery efficacy, impact on chondrocyte viability and efficient editing. The optimisation of the delivery conditions led to a method to efficiently edit almost all the cells, reaching unprecedented KO efficiencies in primary chondrocytes.
In the Appendix, hydrogel compositions were screened to identify the combination that resulted in optimal neocartilage production by polydactyly chondrocytes. The use of an enzymatically crosslinked, hyaluronic acid (HA)-based hydrogel (HA-transglutaminase, HATG) with the addition of alginate or nanofibrils was tested for the promotion of chondrogenesis in vitro. The combination of HATG and low quantities of alginate (HATG-Alg) returned the best results: it promoted cartilaginous matrix deposition, maintained high cell viability and reached high stiffness after three weeks of culture.
The results of the previous two studies were combined in Chapter 3 to generate inflammation-resistant grafts for cartilage tissue regeneration. Polydactyly chondrocytes were genetically modified to KO the transforming growth factor-β associated kinase 1 (TAK1), a common kinase involved in the activation of the inflammatory nuclear factor kappa B (NF-κB) pathway, to avoid the further secretion of inflammatory cytokines and degradation of cartilage by matrix metalloproteinases (MMPs). Gene-edited chondrocytes lacking the TAK1 gene were then encapsulated in the HATG-Alg hydrogel to investigate functional cartilage formation in an inflamed environment. The gene-edited samples showed superior regenerative properties compared to the unedited samples, even in the presence of extremely high concentrations of proinflammatory cytokines in vitro. They also showed less infiltration of proinflammatory macrophages in vivo.
In Chapter 4, the reported characteristics of low-grade inflammation in osteoarthritis (OA) patients due to microbiota dysbiosis were compared in a systematic review of the literature. The aim was to screen for possible common bacterial genera or species that could be implicated in OA pathogenesis. While no common bacterial species were found when comparing the microbiota of the OA patients, a trend was observed in symptom relief and disease improvement when probiotic bacteria were administered.
In Chapter 5, tissue engineering was further explored for the generation of aligned tissue constructs. The use of macroporous, structured hydrogels has already been shown to have a positive impact in cartilage tissue engineering on cell migration and proliferation in the inner hydrogel, increasing cell viability. A gelatin-based, photocrosslinkable hydrogel was used with a novel sizing device to obtain macroporous, highly aligned strands. The regularly aligned structure was employed for the maturation of another connective tissue: muscle. Maturation of muscle fibres was observed even in the inner part of the constructs.
To conclude, this thesis illustrates the use of gene editing in tissue engineering to generate a potentially new superior strategy for cartilage tissue engineering, investigates the role of microbiota in OA patients and provides a new method for muscle tissue in vitro maturation.
I difetti della cartilagine articolare sono una patologia comune che deriva da lesioni, traumi o usura. Se il difetto non viene trattato, spesso non si riesce a ripristinare la superficie cartilaginea, con il rischio di sviluppare un'osteoartrite post-traumatica (PTOA). Quando la malattia raggiunge lo stadio finale della degenerazione della cartilagine, l'unico trattamento possibile è la sostituzione totale dell'articolazione, una procedura che non è ottimale per i pazienti più giovani a causa della durata limitata della protesi. La cartilagine ha una bassa cellularità, manca di vascolarizzazione ed è nota per le sue scarse proprietà rigenerative. Il fenotipo quiescente dei condrociti e l'infiammazione locale nel sito del difetto ostacolano la rigenerazione di una cartilagine ialina sana. I trattamenti attualmente disponibili mirano ad evitare l'insorgenza di PTOA attraverso il ripristino del difetto, stimolando la naturale capacità delle cellule staminali del midollo osseo (BMSC) di migrare e secernere matrice cartilaginea, come nella microfrattura, o fornendo cellule condrogeniche nel sito del difetto, come nell'impianto di condrociti autologhi (ACI). Tuttavia, entrambe le tecniche presentano dei limiti, come i costi elevati e la qualità inferiore di cartilagine prodotta che tende a degenerare nel tempo. Sono quindi necessari approcci alternativi che possano fornire risultati migliori e limitare gli svantaggi.
Grazie alla combinazione di cellule, idrogel e segnali, l'ingegneria tissutale offre nuovi e promettenti strumenti per il trattamento dei difetti della cartilagine. Questa combinazione è già in uso nell'impianto di condrociti autologhi assistito da matrice (MACI), che mostra risultati migliori rispetto ad altri metodi, ma si basa ancora sull'uso di cellule adulte scarsamente condrogeniche e affette da infiammazione. L'uso di condrociti derivati da giovani pazienti polidattili supera i limiti dati dalla scarsa condrogenicità e la necessità di ulteriori interventi chirurgici rispetto ai trattamenti standard basati su cellule autologhe. L'avvento di precisi strumenti di gene editing negli ultimi anni, come il sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, fornisce un'ulteriore ed entusiasmante opzione per modificare le caratteristiche delle cellule nella medicina rigenerativa. Questa tesi mira a sviluppare un approccio innovativo al trattamento dei difetti della cartilagine, stabilendo un protocollo di gene editing migliorato per i condrociti primari (Capitolo 2), identificando la composizione ottimale dell'idrogel per i condrociti primari polidattili (Appendice) e infine combinando i risultati per generare cartilagine ingegnerizzata resistente all'infiammazione per la riparazione dei difetti della cartilagine (Capitolo 3).
Nel capitolo 2 viene descritto un nuovo protocollo di gene editing per ottenere elevati livelli di knockout (KO) nei condrociti primari. In particolare, sono stati confrontati due metodi di somministrazione basati su nanoparticelle lipidiche o elettroporazione, per quanto riguarda l'efficacia della somministrazione, l'impatto sulla vitalità dei condrociti e l'efficienza dell'editing. L'ottimizzazione delle condizioni di somministrazione ha portato a un metodo per modificare in modo efficiente quasi tutte le cellule, raggiungendo efficienze di KO senza precedenti nei condrociti primari.
Nell'Appendice sono state vagliate le composizioni di idrogel per identificare la combinazione che ha portato alla produzione ottimale di neocartilagine da parte dei condrociti polidattili. L'uso di un idrogel a base di acido ialuronico (HA) polimerizzato enzimaticamente con transglutamminasi (TG) (HATG) con l'aggiunta di alginato o nanofibrille è stato testato per la promozione della condrogenesi in vitro. La combinazione di HATG e basse quantità di alginato (HATG-Alg) ha dato i risultati migliori, dimostrando di promuovere la deposizione di matrice cartilaginea, mantenendo un'elevata vitalità cellulare e risultando in un costrutto rigido dopo tre settimane di coltura.
I risultati dei due studi precedenti sono stati combinati nel Capitolo 3 per generare innesti resistenti all'infiammazione per la rigenerazione del tessuto cartilagineo. I condrociti polidattili sono stati geneticamente modificati in modo da ottenere il KO della chinasi 1 associata al fattore di crescita trasformante β (TAK1), una chinasi comunemente coinvolta nell'attivazione della via infiammatoria del fattore nucleare kappa B (NF-κB), per evitare l'ulteriore secrezione di citochine infiammatorie e la degradazione della cartilagine da parte delle metalloproteinasi (MMP). I condrociti geneticamente modificati privi del gene TAK1 sono stati quindi incapsulati nell'idrogel HATG-Alg per studiare la formazione di cartilagine funzionale in un ambiente infiammato. I campioni modificati geneticamente hanno mostrato proprietà rigenerative superiori rispetto ai campioni non modificati, anche in presenza di concentrazioni estremamente elevate di citochine proinfiammatorie in vitro. Inoltre, hanno mostrato una minore infiltrazione di macrofagi proinfiammatori in vivo.
Nel capitolo 4, le caratteristiche riportate dell'infiammazione di basso grado nei pazienti affetti da osteoartrite (OA) dovuta alla disbiosi del microbiota sono state confrontate in una revisione sistematica della letteratura. L'obiettivo era quello di individuare eventuali generi o specie batteriche comuni che potessero essere implicate nella patogenesi dell'OA. Sebbene non siano state trovate specie batteriche comuni quando si è confrontato il microbiota dei pazienti con OA, è stata osservata una tendenza al sollievo dei sintomi e al miglioramento della malattia quando sono stati somministrati batteri probiotici.
Nel Capitolo 5, l'ingegneria tissutale è stata ulteriormente esplorata per la generazione di costrutti tissutali allineati. È già stato dimostrato che l'uso di idrogel macroporosi abbia un impatto positivo nell'ingegneria dei tessuti cartilaginei sulla migrazione e la proliferazione delle cellule nell'idrogel interno, aumentando la vitalità cellulare. Un idrogel fotopolimerizzabile a base di gelatina è stato utilizzato con un nuovo dispositivo di dimensionamento per ottenere filamenti macroporosi e altamente allineati. La struttura regolarmente allineata è stata utilizzata per la maturazione di un altro tessuto connettivo: il muscolo. È stata osservata la maturazione delle fibre muscolari, anche nella parte interna dei costrutti.
In conclusione, questa tesi illustra l'uso del gene editing per generare una strategia potenzialmente superiore per l'ingegneria tissutale della cartilagine, indaga il ruolo del microbiota nei pazienti con OA e fornisce un nuovo metodo per la maturazione del tessuto muscolare.