OCLC: 1017519197
PROQUEST: 304672335
Le cytosquelette des chonârocytes est un réseau tridimensionnel composé de trois types de filaments protéiques (les microfilaments d'actine, les microtubulest les filaments intermédiaires) impliqué dans multiples fonctions cellulaires. Ses études descriptives étant incomplètes et peu nombreuses, de nouveaux travaux sont requis afin d'approfondir notre connaissance de l'organisation ducytoûquelette des chondrocytes in situ.
L'hypothèse à la base de cette étude est que la structure et la composition du cytosquelette in situ varient selon la position en profondeur des chondrocytes dans le cartilage articulaire mature. Ainsi, le premier objectif consistait à examiner l'organisation tridimensionnelle des trois réseaux du cytosqueleîte des chondrocytes in situ. Tel qu'observés au microscope confocal à fluorescence, les trois réseaux de filaments qui fment le cytosquelette possèdent des structures distinctes, mettant ainsi en lumière certains rôles fonctionnels repectifs à chacun de ces réseaux dans les chondrocytes du cartilage articulaire. Le marquage d'actine se situe sous la membrane cellulaire, oii il est dense et ponctuel, tandis que les microtubules et les filaments de vimentine forment un treillis s'étendant de la membrane nucléaire à la membrane plasmique, le ireillis de vimentine étant plus fin et plus serré que celui de microtubules.
Le second objectif de cette étude consistait à examiner la distribution des trois réseaux du cytosquelette des chondrocyîes selon leur position dans le cartilage articulaire. Le contenu hétéroghne des composantes ducytosquelette dans les diffkentes zones du cartilage, tel qu'observé par microscopie à épifluorescence et SDS-PAGE, sugghre un contrôle micruenvironnemental de i'expression du cytosquelette. La distriiution de microfilaments d'ache est plutôt uniforme, dors que les distriiutiom de microtubules et de tilaments intemiedialles suivent un gradient dont l'intensité de marquage est maximale dans la zone superficielle. L'analyse par SDS-PAGE des extraits RIPA et GuCl appuie ces résultats et suggère (1) que le pool d'actine globulaire est plus important dans la zone superficielle que dans les régions profondes, et (2) qu'il existe un pool de vimentine soluble qui est extrait lors de la perméabilisation des coupes pour la microscopie à fluorescence
Suite à ces observations, deux hypothèses ont été proposées relativement au rôles mécaniques ducytosqueletîe des chondrocytes:
De nouvelles expérimentations éant essentielles afin d'approfondir l'étude des fonctions mécaniques du cytosquelette, des travaux complémentaires ont été entrepris afin d'examiner l'hypothèse voulant que des changements d'organisation du cytosquelette surviennent en réponse à des stimuli mécaniques. Plus spécifiquement, le but était d'obtenir des images préliminaires du cytosquelette ainsi que de la phosphorylation des filaments de vimentine des chondrocytes in situ suite a l'application de compressions. II a été observé que la compression dynamique haute vitesse affecte l'organisation du cytosquelette notamment en diaisant te marquage d'actine habituellement ponctue1. Ces essais ont également permis de noter que le patron de phosphorylation du site Sera2 de la vimentine se modifie différemment selon type de compression appliqué.
Ces observations mènent aux hypothèse suivantes :
Parallèlement à ces études biochimiques, il importe de réaliser des études mécaniques pour comprendre la nahue de la réponse du cartilage aux compressions. La corrélation des phénomènes physiques avec les réponses biologiques est nécessaire à la dissection des processus responsables des changements d'organisation et de phosphorylation du cytosquelette. Ainsi, le volet mécanique de cette thèse caractérise le comportement mécanique du cartilage articulaire pour des conditions de chargement similaires à celles utilisées pour l'étude biologique. Cette section du projet avait pour premier objectif de vérifier, si telle que proposé, la réponse mécanique du cartilage articulaire à un essai de relaxation de contrainte peut être linéaire ou non linéaire selon l'amplitude et le taust de déformation, Il a été conclu que la réponse transitoire du cartilage articulaire adulte est non linéaire, s'affaiblissant initialement puis se rigidifiant significativement lorsque l'amplitude de la déformation augmente. Elle démontre aussi une grande sensibilité au taux de déformation, son renforcement étant plus important pour une vitesse élevée de compression. La réponse à l'équilibre, elle, put être linéaire ou non selon le taux de déformation utilisé. Les modules à l'équilibre augmentent avecl'amplitude de la déformation a basse vitesse, sont constants à vitesse moyenne haute vitesse. Des compressions réalisées sur des échantillons congelés ont démontré que ces derniers présentent moins de résistances aux compressions, leurs modules normalisés, -toires et à l'équilibre, étant inférieurs à ceux des échantillons fia
Le protocole conçu pour évaluer l'étendue de la linéarité requiert l'application d'une série de compressions d'amplitudes croissantes allant jusqu'à - 26,s % de déformation. il a été supposé que pour ces niveaux de déformation, des endommagements peuvent être causés à la matricextracellulaire affectant la mesure de linéarité, d'où le second objectif, celui d'examiner les atérations dans le comportement du cartilage articulaire causées par le chargement mécanique en compression non confinée. Un affaiblissement de la matrice extracellulaire a été noté suite à des compressions d'aussi faible amplitude que 25-50 μm.
Suite à ces travaux, des hypothèses ont été proposées expliquant les comportements observés du cartilage articulaire:
Cette thèse nous a permis d'acquérir de nouvelles connaissances concernant le cytosquelette des chondrocytes in situ et le comportement du cartilage articulaire mature en compression confinée. Plus précisément, l'étude du cytosquelette dévoile l'organisation etla distribution des mis protéines du cytosquelette et présente les changements d'organisation du cytosquelette enréponse à des stimuli mécaniques variés. L'examen des changements dephosphorylation de la virnentine, quant à lui, constitue lapremière étude de ce genre. En ce qui concerne l'analyse mécanique, il s'agit de la seule étude portant sur la linéaritétnon-linéarité de laréponse du cartiiage articulaire à des déformations finies appliquéesn géométrie non confinée. Elle a aussi l'exclusivité d'examiner ladépendance dla linéarité envers la vitesse de déformation. De plus, le protocole & compression conçu pour I'expénmentation estunique étant donné qu'il permet de déterminer leniveau de déformation critique où débute la dégradation des propriétés mécaniques dumatériau. Toutes ces nouvelles informations sont essentielles à la compréhension dufonctionnement physiologique du cartilage articulaire ainsi qu'au dévebppementt à l'évolution de l'ostéoarîhrit
The chonbyte cytoskeleton is a three-dimensiornai network composed of tiuee types of protein filaments (actin microfilaments, microtubules and intermediate filaments) involved in multiple cellular functions. Since there are limited studies of the chondrocyte cytoskeleton, additional investigation is required in order to increase our knowledge ofthe chondrocyte cytoskeleton organisation in situ.
This study is based on the hypothesis that in situ cytoskeleton structure and composition Vary with depth in mature articular cartilage. Thus, the first objective consisted of the examination ofthe three-dimensiornai organisation of the chondrocyte cytoskeleton networks in situ. As observed by confocal fluorescence microscopy, the thtee filament networks fonning the cytoskeleton possess distinct structures, highiighting certain functional des of these systems in chondrocytes of articular cartilage. Actin labeliing localizes beneath the cellular membrane, where it is dense and punctual, whereas microhibules and vimentin filaments form a basket-like mesh spanning hm the plasma membrane to the nuclear membrane, vimentin's mesh being thinner and tighter than microtubule's.
The second objectif of this study consisted of the examination of the distributionf the three cytoskeletal networks as a function of depth in mature articular cartilage. The heterogeneous content of cytoskeleton components in the different cartilage zones, as observed by epifluorescence microscopy and SDS-PAGE, suggested a microenvironnemental regulation of cytoskeleton expression. Actin microfilament distriiution is mostly uniform, whereas microtubde and Mmentin filament disûiibutions follows a gradient with maximal IabeUing intensity inthe superficial zone. SDS-PAGE analysis of RIPA and GuCl extracts supported these results and suggested (1) that the globular actin pl is larger in the superficial compared to the deeper regions, and (2) that therexists a soluble vimenîin pool whicb is extracteci during slice pemieabiiisation for fluorescence microscopy.
Following these obsewations, two hypothesis were proposed conceming the chondrocyîe cytoskeleton mecfianical functions:
Since further experimentation is essential todeepen the study of mechanical functions of the cytoskeleton, complementary work was undertaken to examine the hypothesis that organisation changes occur in response to mechanical stimulations. More specincally, the goal was to obtain prelirninary images of the cytoskeleton as well as of the phosphorylation state of vimentin filaments of chondrocytes in situ following mechanical compression. We obmed that high speed dyaamicompression aff'ected the cytoskeleton organisation, notably by ûansforming a nodly punctuated actin Iabelling into a more diffuse one. These tests also allowed us to note that virnentin Ser82 phosphorylation pattern was modified differentially accordhg to the applied compression type.
These observation lead to the following hypothesis:
Together with these biochemid studies, itis important toperform mechanicd studies in order to understand the character of cartilage response to compressions. Correlation of physical phenomenon witb biological responses inecessary to the dissection of organisation ad phosphorylation changes pnocess. Thus, the mechanical aspect of this thesis focused on the characterisation of tbe mechanicd behaviour of articuiar cartilage for loading conditions similar to those used in the biological study. This section of the project had as a ht hypothesis that articular cartilage mechanical response to a stress relaxation tests canbe linear or non-Iinear according todefonnation amplitude and rate. The transient response ofadult atticular cartilage was found to be non-linear, initially weakening and then significantly stiffening with increasing deformation. It also showed sensitivity to strain rate, its stiffening being more significant at high than at low compression speed. Equilibrium response can be linear or not according tothe strain rate used. At low strain rate, equilibrium response nonlinearly stiffens with increasing compression amplitude while it is constant at intermediate and high strain rate. Compression applied to ikedthawed specimens showed the latter to offer less resistance to compressions since tbeir nonnalisecl peak and equiliirium moduii are lower than those of flesh non-fonen specimens.
The protocol conceived to evaluate the extent of linearity required the application of a compression series of increasing ampliaide up to - 26,s % defomation. It was hypothesised that, for these defmtion Ievelg damage to the extracellular matrix can occur. Hence, the second objective consistai of examining alterations of the articular cartilage behavior caused by mechanical loading in unconfîned compression. We noticed aweakening ofthe extracellular matrix foiiowing compressions of amplitude as low as 25-50 μm.
From this work, hypotheses were proposed to explain observed behavior of articular cartilage:
This thesis alkwed us to deepen our knowledge of in situ chondrocyte cytoskeleton ad mechanical behaviour of mature articular cartilage under unconfineciompression. Mote precisely, the cytoskeleton study revealed the organisation and disûibution of the three cytoskeletal proteins and presented cytoskeleton organisation changes in response to various mechanical stimuli. The examination of vimentin phosphorylation changes, for its part, constitutes the 6rst study of this type. Conceming the mechanical analysis, this is the only study focussing on the linearityln~nlinea~ty of the articular cartilage response to finite deformation appüed in uncoafmed compression, and the only one to examine the dependence of Iinearity on strain rate. Furthemore, the testing protocol designeci for this experiment is unique since it allows for detemiination of a critical defocmation level where material mechanical property degradation begins. Al1 of this new infornation is essential for the comprehension of articulsrr cartilage mechanics and fiinction inphysiological situations as well as in the camprehension of osteoarthntis etiology and pathogenes