The healing of bone is a remarkable process, involving numerous signalling factors, cell types and tissue types. This process allows damaged bone to regenerate scarlessly, such that the healed bone can fulfil its original function. However, there are circumstances in which the natural healing process is insufficient. In these cases, the healing must be aided through clinical intervention, either in adjusting the stability at which the fracture is fixed, or through adding osteoinductive material in order to promote healing. Pre-clinical development of these osteoinductive materials starts with in vitro testing, once the efficacy of the material has been proven it can then move to in vivo models. The use of in silico models has the potential to both refine and accelerate this development process. Many in silico models for fracture healing exist, but currently they are limited in resolution and there is a lack of appropriate validation data. However, tools such as in vivo micro-computed tomography (micro-CT) allow the non-invasive imaging of the healing tissue, giving insight as to the internal structure. Longitudinal measurement opens the possibility to study the evolution of the structure. Moreover, they reduce the number of animals required per study as measurements can be made on the same animal at multiple timepoints. Crucially they can provide important information to parametrise and validate in silico models.

To address these issues three aims were defined:​ (1) develop and perform analysis on longitudinal in vivo micro-CT images of healing bone in order to quantify mechanoregulation of the healing process, (2) quantify the effects of implanted scaffolds on the local mechanical environment in the defect, and (3) develop a computational simulation for mechanically regulated fracture healing.

For the first aim, a pipeline was developed which allowed the alignment and segmentation of the in vivo micro-CT images. The physiological loading of the mouse hind limb was determined and was used as a boundary condition for micro-FE analysis of the defect. Using the mechanical strains calculated at preceding timepoints as classifiers for bone formation, a threshold strain at which bone formation occurred was found. This analysis was repeated for a whole range of density based segmentations, revealing the links between formation, maturation and (re)modeling of the tissue and the local mechanical environment. To our knowledge this was the first study to systematically quantify the mechanoregulation of healing bone using longitudinal in vivo measurement.

For the second aim, an analysis was devised in which the mechanobiological information determined in the first aim, was used to estimate the effects of introducing a tissue engineered scaffold to the defect. The analysis was applied to a single group of mice. We found that there is a range of scaffold stiffness for which there is an increase in the potential region in which the mechanical stimulation is osteoinductive. This method provides a simple tool for estimating the effects of scaffold designs on the local mechanical environment and has potential use when translating designs from in vitro to in vivo models.

The third aim of the project was to develop a simulation framework for studying fracture healing. The model developed combined the paradigms of agent based modeling with multi-physics simulation. Micro-finite element was used to calculate the mechanical stimulation. The reaction-diffusion of molecules was calculated using a bespoke solver. Cells are modelled as individual agents sensitive to their chemical and mechanical environment. The RANKL-OPG axis, TGF-β signalling, along with Sclerostin were included in the model. The simulation can produce realistic microstructural detail of the callus.

In conclusion, this thesis presents methods for non-invasive study of fracture healing which can be used to refine the design of animal studies. The experimental results provide new insights into the mechanical regulation and timing for the fracture healing process. Finally, the computational model presented has the potential to be used for in silico testing of biomaterials and pharmaceuticals. The model also has scope to be applied to test hypothesis related to the fundamental biology of fracture healing and bone remodelling

Knochenheilung ist ein bemerkenswerter Prozess, bei dem mehrere Zytokine, die Zellabstammung sowie Gewebetypen eine Rolle spielen. Beschädigter Knochen wird dabei soweit regeneriert, dass er seine ursprüngliche Funktion wieder aufnehmen kann.

Allerdings gibt es auch Situationen, in denen die natürliche Heilung nicht ausreicht. In diesen Fällen muss mit klinischen Interventionen nachgeholfen werden. Dies kann entweder mit einer Anpassung der Stabilität, bei der die Fraktur fixiert wird oder auch mit der Zugabe von osteoinduktiven Substanzen geschehen. Die vorklinische Entwicklung dieser osteoinduktiven Substanzen beginnt jeweils mit in vitro-Tests:​ falls deren Wirksamkeit damit bestätigt wird, folgen in vivo Untersuchungen. Dieser Entwicklungsprozess kann mit der Hilfe von in silico-Modellen beschleunigt und präzisiert werden. Es existieren bereits viele solcher in silico-Modelle für Knochenheilung, sie waren bis anhin aber limitiert in ihrer Auflösung und durch einen Mangel an geeigneten Validierungsdaten. Methoden wie die in vivo Micro-Computertomografie (micro-CT) können dem jedoch Abhilfe schaffen, indem man das heilende Gewebe nicht-invasiv darstellen kann und dabei Einblicke in die interne Struktur gewinnt.

Longitudinale Messungen ermöglichen es zusätzlich, die Entwicklung der Struktur zu untersuchen. Ausserdem verringern sie die Anzahl an benötigten Tieren, da man dieselben Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten vermisst. Somit sind sie ein wertvolles Hilfsmittel, um die Parameter für in silico-Modelle zu bestimmen und sie zusätzlich zu validieren.

Um sich mit der geringen Auflösung der bisherigen Modelle und den spärlich vorhandenen Validierungsdaten auseinanderzusetzen, wurden folgende drei Ziele definiert:​ (1) Entwicklung und Durchführung einer longitudinalen in vivo micro-CT Analyse, mit der heilender Knochen abgebildet wird, damit die Mechanoregulation des Heilungsprozesses quantifiziert werden kann, (2) Quantifizierung des Einflusses von implantierten Scaffolds auf die lokale, mechanische Situation im Defekt und (3) die Entwicklung einer rechnergestützten Simulation für mechanisch regulierte Knochenheilung.

Um das erste Ziel zu erreichen wurde eine Pipline entwickelt, die die Segmentierung und das Ausrichten der in vivo micro-CT Bilder erlaubt. Die physiologische Belastung von Maus-Hinterbeinen wurde bestimmt und anschliessend als Randbedingung für die micro-FE Analyse des Defekts verwendet. Die mechanische Belastung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten berechnet und als Klassifikator für Knochenbildung verwendet. Damit konnte ein Schwellwert für die Dehnung bestimmt werden, bei der sich Knochen bildet. Diese Analyse wurde wiederholt für eine Vielzahl von nach Dichte eingeteilten Segmenten, welche den Zusammenhang zwischen Bildung, Maturation und (Wieder-)Aufbau des Gewebes und der mechanischen Umgebung offenlegte. Nach unserem aktuellen Wissensstand war dies die erste Studie, die systematisch die Mechanoregulation von heilendem Knochen quantifizierte unter Verwendung einer longitudinalen in vivo Messung.

Die mechano-biologischen Daten aus dem ersten Teil der Arbeit wurden verwendet, um den Einfluss eines tissue engineered scaffold auf den Defekt auszuwerten und damit eine Antwort auf die zweite Fragestellung zu liefern. Diese Analyse wurde auf eine Gruppe Mäuse angewendet. Wir konnten einen Bereich der scaffold-Steifigkeit bestimmen, der die potenzielle Region für Knochenwachstum erhöht. Diese Methode erlaubt es uns, eine Abschätzung des Effekts vom scaffold-Design auf die mechanische Umgebung zu machen und könnte in der Zukunft verwendet werden, wenn Designs von in vitro- auf in vivoModelle übertragen werden.

Das dritte Ziel dieses Projektes war die Entwicklung eines Modelles, mit dem Knochenheilung simuliert und untersucht werden kann. Es kombiniert agentbasiertes Modellieren mit multi-physikalischer Simulation. Micro-finite Elemente wurden zur Berechnung der mechanischen Stimulation verwendet. Die Reaktionsdiffusion der Moleküle wurde mit einem selbsterstellten Gleichungslöser berechnet. Die Zellen reagierten individuell auf ihre chemische und mechanische Umgebung. Die RANKL-OPG Achse, TGF-β Signalisation und Sclerostin wurden in das Modell integriert. Die Simulation ist in der Lage, realistische mikrostrukturelle Details des Kallus darzustellen.

Diese Doktorarbeit präsentiert also Methoden für nicht-invasive Untersuchungen von Knochenheilung, welche verwendet werden können, um den Aufbau von Tierversuchen weiterzuentwickeln. Die experimentellen Resultate gewähren uns einen neuen Einblick in die mechanische Regulation und den zeitlichen Ablauf des Knochenheilungsprozesses. Abschliessend kann man sagen, dass das präsentierte Modell das Potential hat, für die in silico-Tests von Biomaterialien und Medikamenten verwendet zu werden. Es könnte auch zum Einsatz kommen um Hypothesen in der fundamentalen Biologie der Knochenheilung oder des Knochen-Remodellings zu testen.