Due to its avascular nature, articular cartilage lacks a primary repair mechanism. Surgery is the main treatment in case of severe lesions and one of the gold standard therapies is autologous chondrocyte implantation (ACI). ACI relies on the isolation of chondrocytes from a non-load bearing region of articular cartilage, their expansion and reinjection into the defect. Despite constant improvements of the technique since its introduction in 1994, several limitations still exist. First, the small biopsy taken from the non-load bearing cartilage can only provide a limited amount of cells. This leads to a long and costly cell expansion step after isolation, known to be associated with chondrocyte dedifferentiation. Secondly, the onset of cartilaginous matrix deposition by chondrocytes, without external stimuli, can be very slow (up to 2 years). Thirdly, during reinjection of chondrocytes via arthroscopy, the cells can suffer from high shear stresses, possibly leading to cell damage and further dedifferentiation. Although several approaches have been presented in the literature, alternative therapies have struggled to emerge due to the long and expensive path required to reach the clinics, the costs being partly due to the necessity to follow the good manufacturing practice when producing the medicine and the good laboratory practice throughout the whole pre-clinical development, including in vivo studies. This thesis presents methods and techniques aiming to develop and further characterize novel approaches to overcome the aforementioned ACI limitations.

The first part of this thesis focuses on the development of a chondro-inductive environment to favour an early onset of cartilaginous matrix deposition. This was achieved by recreating the highly sulfated environment present in the native healthy cartilage extracellular matrix. An engineered enzymatically-crosslinked hyaluronan hydrogel (HA-TG for HyaluronanTransglutaminase) was used as a base scaffold and its chondrogenicity was improved by covalently crosslinking heparin, a sulfated polysaccharide, to the hyaluronan backbone. The new biomaterial, HA-TG/Hep-TG, was quantitatively characterized in terms of TGF-β1 release kinetics, promotion of cell viability and proliferation in response to a range of TGF-β1 doses. The qualitative characterization included staining of matrix components. The study showed how covalent grafting of heparin to the hyaluronan backbone allowed a sustained release of the chondrogenic growth factor TGF-β1. The encapsulated fetal chondrocytes displayed a TGF-β1 dose dependency for viability, proliferation and matrix deposition. Translatability of the developed technique was also evaluated in vivo. The regeneration potential of this hydrogel combined with a collagen sponge was evaluated qualitatively and semi-quantitatively via histological scores in a defect model in the ovine stifle joint. Based on histological results, a comparison was made with the widely-used ectopic subcutaneous implantation model in mice.

The in vitro findings could not be translated in vivo in either a mouse or a sheep model, since the addition of sustainably released TGF-β1 to the HA-TG hydrogels did not promote or enhance cartilage regeneration. Only in the sheep model, acellular TGF-β1-free hydrogels were found to be the most promising combination. The same conditions tested in the subcutaneous implantation model in mice were shown to be useful for the study of scaffolds’ stability and resistance to vascularization, but the limitations of this model in terms of low prediction of cell infiltration and chondrogenic potential were highlighted.

The second part of this thesis presents the potential benefits of cell encapsulation in microgels as an alternative to bulk encapsulation. Cells were microencapsulated in a gelatin-methacrylate hydrogel using a microfluidics device and after being crosslinked, the microgels were annealed with polyethyleneglycol-N-hydroxysuccinimide to study tissue maturation in vitro and in vivo in a subcutaneous mouse model. The study included the quantitative determination of cell migration, chondrogenic gene expression and mechanical properties, together with the qualitative observation of matrix production. Cell microencapsulation led to an increase in expression of cartilage-specific genes in a TGF-β1-dependent manner, which correlated with cartilaginous matrix deposition after migration to the surface of the microgels. Subcutaneous implantation of precultured scaffolds in mice resulted in vessel infiltration in bulk gels but not in assembled microgels. However, for both conditions, the cells greatly remodeled their environment after 5 weeks in vivo, causing a severe shrinkage of the constructs.

The use of cell isolation has been challenged in the clinics by the introduction of CAIS (cartilage autograft implantation system), a procedure in which cartilage tissue from the biopsy is minced and implanted in the patient’s cartilage defect. The underlying idea is to maintain chondrocyte phenotype by implanting small cartilage particles rather than isolated and expanded cells into the lesion, which relies on the capacity of chondrocytes to outgrow and deposit matrix upon encapsulation in a biomaterial. In the third part of this thesis, in a view to standardize and accelerate CAIS procedure in the operation room, a mincing device was characterized. The size of the device-generated particles was quantified and compared to hand-mincing-generated particles. The migration potential in two clinically used biomaterials (fibrin glue, produced by Baxter, and a gel of collagen fibrils entrapped in a clot of platelet-rich plasma, commercialized by CollPlant) was semi-quantitatively defined and the type of matrix deposited by the cells in vitro in these same two biomaterials was qualitatively investigated. This study determined that the outgrowth potential, the viability and the matrix deposition by the cells within the minced tissue after 28 days in culture, were unchanged between device- and hand-mincing and between the two tested biomaterials. No matrix was deposited in the biomaterial during the in vitro culture. Nevertheless, device mincing showed advantages in terms of speed and small size of the generated cartilage particles. Considering the body of literature demonstrating the potential of minced cartilage from non-load bearing regions for repair of articular cartilage defects, this device could potentially be used by surgeons in the operation room to simplify the surgical process.

The fourth part of the thesis focuses on a particular case of lesions with partially delaminated cartilage (“flaps”) in patients with femoroacetabular impingement. ACI has been performed to a small extent to treat these lesions after resection of the delaminated tissue, but a refixation technique with fibrin glue has recently been suggested based on the reported presence of viable cells in flaps. A scientific rationale for refixation of delaminated cartilage is investigated, by quantifying chondrocyte viability, semi-quantifying the migration potential of the residing chondrocytes into fibrin glue, qualitatively describing the state of the extracellular matrix in flaps and the ability of the cells to deposit cartilage matrix in a pellet assay. Despite the presence of viable chondrocytes with migration potential, the cells reside in a structurally altered ECM and have limited capacity to deposit ECM. Their capacity to produce sufficient ECM within the fibrin sealant for stable long-term attachment of such flaps is therefore questioned.

This thesis aims to tackle several limitations of the current gold standard treatments of cartilage lesions with the development and/or the characterization of various approaches and their translatability to the clinics. It illustrates the difficult translation from in vitro to in vivo and investigates several biomaterials (HA-TG, gelatin-methacrylate, fibrin glue, collagen) to either encapsulate cells or cartilage particles to support the generation of a cartilaginous tissue. This thesis therefore paves the way to the development of cartilage tissue engineering strategies.

En raison de sa nature avasculaire, le cartilage articulaire ne possède pas les mécanismes primaires de réparation. En cas de lésions graves, les traitements sont principalement chirurgicaux et un des traitements de référence est l'implantation de chondrocytes autologues (ICA). L'ICA consiste en l'isolement de chondrocytes à partir d’une biopsie réalisée dans une région non portante du cartilage articulaire, leur culture in vitro et leur réinjection dans la lésion. La dernière génération d'ICA inclut l'utilisation d'un biomatériau dans lequel les cellules sont encapsulées. Malgré des améliorations constantes depuis l’introduction de l’ICA en 1994, plusieurs limites subsistent. Premièrement, la quantité limitée de cellules dans la biopsie nécessite une expansion longue et coûteuse après l'isolement, ce qui est associé à la dédifférenciation des chondrocytes. Deuxièmement, il existe un délai atteignant jusqu’à 2 ans avant que les cellules ne produisent une matrice d’apparence hyaline, ce qui motive le développement de matériaux pouvant induire la chondrogenèse (« chondro-inductifs »). Troisièmement, les cellules peuvent souffrir d'un stress de cisaillement élevé pendant l'administration par arthroscopie. Finalement, une limitation plus globale du développement de thérapies alternatives par les laboratoires universitaires est le long et coûteux chemin pour mener un produit sur le marché, les coûts étant en partie dus à la nécessité de respecter les Bonnes Pratiques de Fabrication pendant la production du médicament et les Bonnes Pratiques de Laboratoire pendant tout le développement préclinique, incluant les études dans les modèles animaux. Le but de cette thèse est de développer, ou de caractériser davantage, des approches pour améliorer les limites mentionnées ci-dessus et leur potentiel de transfert du laboratoire à la clinique.

Dans une première partie, nous nous sommes concentrés sur le développement d'un environnement chondro-inductif, en recréant l'environnement hautement sulfaté de la matrice extracellulaire du cartilage. Pour améliorer la chondrogénicité d'un hydrogel d'hyaluronane réticulé enzymatiquement (HA-TG pour Hyaluronan-Transglutaminase), nous y avons attaché covalemment de l'héparine, un polysaccharide sulfaté. Nous avons caractérisé quantitativement le nouveau biomatériau, HA-TG/Hep-TG, en termes de cinétique de libération du facteur de croissance TGF-β1 et de favorisation de la viabilité et de la prolifération cellulaire en réponse à une série de doses de TGF-β1. L’aspect translationel de cette approche a été évaluée in vivo. Les différents composants de la matrix extracellulaire produite ont été caractérisés qualitativement par histologie. Nous avons en outre défini qualitativement et semi-quantitativement, par le biais de scores histologiques, le potentiel de régénération de cet hydrogel combiné à un échafaud de collagène dans un modèle de lésion du cartilage de l’articulation fémoro-tibiale chez le mouton. Une comparaison a été faite avec le modèle largement utilTable of contisé d'implantation ectopique souscutanée chez la souris, basée sur les résultats histologiques, pour définir la translatabilité des résultats dans les trois systèmes (in vitro, in vivo chez le mouton et la souris). Nous avons montré que la greffe covalente d'héparine entraînait une libération prolongée du facteur de croissance chondrogénique TGF-β1, qui était cruciale pour la production de matrice extracellulaire, et que la viabilité, la prolifération et la production de matrice extracellulaire par les chondrocytes fœtaux encapsulés était dose-dépendants.

Les résultats in vitro n'ont pas pu être transposés in vivo dans un modèle rongeur ou ovin, car l'ajout de TGF-β1 à libération prolongée n'a pas favorisé ou amélioré la régénération du cartilage. Seulement dans le modèle ovin, les hydrogels d’HA-TG acellulaires et ne contenant pas de TGF-β1 se sont avérés être plus prometteurs pour la régénération du cartilage. L’étude dans un modèle d'implantation sous-cutanée chez la souris s’est révélée utile pour la caractérisation de la stabilité et de la résistance à la vascularisation des hydrogels, mais les limites de ce modèle en termes de faible pouvoir de prédiction de l’invasion cellulaire et du potentiel chondrogénique ont été mises en évidence.

Comme alternative à l'encapsulation de cellules dans un bloc d’hydrogel, nous avons étudié les avantages potentiels de la microencapsulation dans la deuxième partie de la thèse. Nous avons encapsulé des chondrocytes fœtaux dans de la gélatine méthacrylatée à l'aide d'un dispositif microfluidique et covalemment assemblé les microgels avec du polyéthylèneglycol-Nhydroxysuccinimide. Nous avons étudié la maturation des tissus ainsi générés in vitro et in vivo dans un modèle d’implantation sous-cutané chez la souris. L'étude a inclut la détermination quantitative de la migration cellulaire, du niveau d’expression des gènes chondrogéniques et des propriétés mécaniques, ainsi que l'observation qualitative de la production de matrice extracellulaire. Nous avons observé que la microencapsulation cellulaire conduit à une expression accrue des gènes spécifiques du cartilage dépendamment du régime d’administration de TGF-β1, ces résultats étant corrélés au niveau de production de matrice extracellulaire cartilagineuse après migration des cellules vers la surface des microgels. L'implantation sous-cutanée d’hydrogels, précultivés in vitro, chez la souris a provoqué l'infiltration de vaisseaux dans des gels « en blocs » mais pas dans des microgels assemblés. Cependant, les cellules ont considérablement remodelé leur environnement après 5 semaines in vivo, provoquant un sévère rétrécissement des hydrogels implantés. La microencapsulation est donc prometteuse pour l’administration de cellules, mais la stabilité in vivo devrait être améliorée pour une utilisation ultérieure en ingénierie tissulaire du cartilage.

L'utilisation de l'isolement cellulaire a été remise en question en clinique avec l'introduction du CAIS (« système d'implantation d'autogreffes de cartilage »), procédure chirurgicale dans laquelle le tissu cartilagineux issu de la biopsie est haché et implanté dans la lésion du cartilage articulaire du patient. L'idée sous-jacente est de maintenir le phénotype des chondrocytes en implantant de petites particules de cartilage plutôt que des cellules isolées et cultivées dans la lésion, ce qui repose sur la capacité des chondrocytes à migrer hors des particules et à déposer de la matrice après encapsulation dans un biomatériau. Dans la troisième partie de cette thèse, en vue de standardiser et d'accélérer la procédure CAIS en salle d'opération, un dispositif permettant de hacher finement le cartilage a été caractérisé. Nous avons quantifié la taille des particules générées par rapport à la découpe manuelle, défini de manière semi-quantitative le potentiel de migration des chondrocytes deux biomatériaux utilisés en clinique (gel de fibrine produit par Baxter et collagène colmaté par du plasma riche en plaquettes commercialisé par CollPlant) et étudié de manière qualitative le type de matrice extracellulaire produite par les cellules dans ces deux différents biomatériaux, in vitro. Le potentiel de croissance, la viabilité après 28 jours en culture et la production de matrice étaient similaires entre les deux méthodes de découpe (à la main vs avec le dispositif) et entre les deux biomatériaux testés. Néanmoins, le processus était plus rapide avec le dispositif et plus efficace pour produire des particules de cartilage significativement plus petites. Considérant l'ensemble de la littérature démontrant le potentiel de l’utilisation de particules de cartilage provenant de régions non porteuses pour le traitement des lésions du cartilage articulaire, ce dispositif pourrait potentiellement être utilisé par les chirurgiens en salle d'opération pour simplifier le processus chirurgical.

La quatrième partie s'est concentrée sur un cas particulier de lésions avec délamination partielle du cartilage chez des patients présentant un impact fémoroacétabulaire. L'ICA a été occasionnellement réalisée pour traiter ces lésions après résection du tissu délaminé, mais une technique de refixation avec de la colle de fibrine a récemment été suggérée du fait de la présence de cellules viables dans le tissu délaminé. Nous avons cherché à définir une justification scientifique à la refixation du cartilage délaminé, en quantifiant la viabilité des chondrocytes, en semi-quantifiant le potentiel de migration dans la colle de fibrine des chondrocytes résidents dans le tissu, et en décrivant qualitativement l'état de la matrice extracellulaire et la capacité des cellules à produire une matrice cartilagineuse. Malgré la présence de chondrocytes viables pouvant migrer dans la colle de fibrine, les cellules résident dans une matrice structurellement altérée et ont une capacité limitée de production de matrice cartilagineuse, ce qui nous a amené à nous interroger sur leur capacité à produire suffisamment de matrice dans la colle de fibrine pour une refixation du cartilage délaminé stable sur le long terme.

Cette thèse a pour but d'aborder plusieurs limitations du traitement actuel des lésions cartilagineuses par ICA, avec le développement et/ou la caractérisation de diverses approches et leur translation vers la clinique. Elle illustre la difficile translation de l'in vitro vers l’in vivo et étudie plusieurs biomatériaux (HA-TG, gélatine-méthacrylate, colle de fibrine, collagène dans un coagulât de PRP) pour encapsuler les cellules ou les particules de cartilage afin de générer un tissu cartilagineux. Cette thèse pose donc des bases pour l'élaboration de stratégies d'ingénierie du tissu cartilagineux.