Articular cartilage injuries can occur after traumatic impacts and from wear and tear. Due to the lack of vascularization and low cellularity, damaged cartilage does not heal spontaneously and, if left untreated, cartilage lesions can lead to the development of posttraumatic osteoarthritis (PTOA). While conservative approaches mostly consist of symptom management, they are only viable for short-term pain reduction. The standard treatment for end-stage cartilage degeneration is the total replacement of the joint. This procedure is highly invasive and the prosthesis have limited lifespans, making this intervention undesirable for young patients. Alternative surgical treatments for earlystage cartilage lesions (e.g. microfracture and autologous chondrocyte implantation) present several limitations that include inferior repair tissue quality, donor site morbidity and the need for a two-step surgery. Therefore, alternative new approaches to repair cartilage injuries would be highly desirable.

Tissue engineering, a method that combines cells, materials and signals for the restoration of tissues and organs, represents a valuable approach for the development of cartilage repair techniques. The aim of this thesis was to develop and investigate novel, tissueengineered strategies to treat articular cartilage lesions. Different cell types were extensively characterized in vitro and compared to the clinical standards. Additionally, an injectable hydrogel was developed and proposed as a biomaterial for cartilage applications. Finally, the safety and efficacy of the combination of cells and scaffold was evaluated in vivo, both subcutaneously in several mouse strains and in a full-thickness defect model in sheep.

In the first part of this thesis, human chondroprogenitor cells (hCCs) from fetal origin are introduced as an off-the-shelf cell source for cartilage engineering applications. Chondroprogenitor cells, adult chondrocytes and mesenchymal stem cells were compared to each other in vitro, based on their chondrogenic differentiation (glycosaminoglycan deposition and collagen 2 to 1 as well as Sox9 to Scleraxis and TGIF mRNA ratio) and phenotypic stability (collagen 10, indian hedgehog, and parathyroid hormone 1 receptor gene expression). While hCCs showed a high chondrogenic potential in vitro, they also demonstrated resistance to mineralization and vascularization, retention of cartilage matrix and production of de novo matrix in a subcutaneous mouse model.

In a second step, a novel hydrogel was characterized for its potential for cartilage engineering applications. Hyaluronic acid-transglutaminase, or HA-TG, was synthetized by functionalizing high molecular weight hyaluronan (HA) with transglutaminase (TG) crosslinkable peptides. Thanks to its fast gelation, its strong adhesion to native cartilage and the possibility to inject it via arthroscopical procedures, HA-TG was proved to be a promising biomaterial for cartilage engineering approaches. In chapter 3, we investigated HA-TG ability to promote the proliferation and chondrogenic differentiation of hCCs in vitro. In chapter 4, HA-TG was tested in combination with either human auricular chondrocytes (hAURs) or hCCs subcutaneously in four mouse strains with varying immune backgrounds. HA-TG chondro-inductivity and resistance to host infiltration was demonstrated in fully immunocompromised (i.e. NOD scid gamma or NSG), athymic (nude), humanized (NSG-SGM3) and fully immunocompetent (C57BL/6 or black 6) animals.

In chapter 5, we proposed another alternative cell type for cartilage engineering applications, namely infant chondrocytes from polydactyly. Thanks to their availability and origin, infant chondrocytes overcome the ethical limitations of hCCs and provide an alternative off-the-shelf source of chondrocytes. The dedifferentiation and redifferentiation profiles of infant polydactyly chondrocytes were extensively characterized in 2D and in 3D, both in centrifuged pellet culture and in HA-TG hydrogels. This chapter also introduces the possibility of augmenting HA-TG hydrogels with heparin moieties and loading the hydrogels with the chondrogenic growth factor TGF-β1. Infant polydactyly chondrocytes were tested in this optimized hydrogel in vitro, ex vivo in a bovine explant model and in a subcutaneous mouse model, demonstrating the potential use of polydactyly chondrocytes for cartilage engineering applications.

Finally, as large animal models are a recommended step in the regulatory translation of new tissue engineering treatments for articular cartilage repair, the HA-TG hydrogel system was tested in a clinically relevant sheep model. Full thickness, chondral defects were treated with either cellular or acellular HA-TG as well as with and without exogenous TGF-β1 loading. This chapter shows that that HA-TG can successfully mediate the integration of the grafts to the native tissue and has the potential to induce de-novo cartilage formation in a large animal model.

To conclude, this thesis illustrates the potential of two cell types (fetal chondroprogenitor cells and infant polydactyly chondrocytes) and an injectable, adhesive scaffold (HA-TG) for cartilage engineering applications, contributing to the development of new treatments for articular cartilage repair.

Traumi, ma anche il ofisiologico utilizzo delle articolazioni, possono provocare lesioni alla cartilagine articolare. A causa della sua natura avascolare e della sua bassa densità cellulare, la cartilagine non possiede meccanismi di auto-rigenerazione e le lesioni cartilaginee, se non curate, possono portare allo sviluppo di osteoartrite post-traumatica (PTOA). Attualmente il trattamento conservativo dei danni cartilaginei è sintomatico e consiste principalmente nella somministrazione di analgesici. Per gli stadi degenerativi terminali l’unica soluzione sono gli interventi di impianto di protesi articolare. Quest’operazione è invasiva e, data la durata limitata delle protesi, non consigliabile per pazienti giovani. Interventi chirurgici alternativi, in particolare le microfratture e gli impianti di condrociti autologhi (ACI), presentano molti svantaggi che includono la necessità di due interventi e la formazione di tessuti cicatriziali di qualità inferiore alla cartilagine nativa. Pertanto, nuovi trattamenti chirurgici per riparare le lesioni cartilaginee sarebbero altamente desiderabili.

L’ingegneria tissutale, intesa come combinazione di cellule, materiali e segnali biologici, è un approccio interessante per lo sviluppo di tecniche chirurgiche che mirano alla rigenerazione della cartilagine. Lo scopo di questa tesi è di ricercare nuove strategie di ingegneria tissutale per il trattamento delle lesioni alla cartilagine articolare. In primo luogo, diversi tipi di cellule vengono esaustivamente caratterizzati in vitro e confrontati con lo standard clinico. Inoltre un nuovo idrogelo iniettabile viene sviluppato e ottimizzato per essere usato come biomateriale per le tecniche di rigenerazione della cartilagine. Infine, la combinazione delle cellule con il biomateriale viene testata in vari modelli murini e ovini per assicurarne la biocompatibilità ed efficacia in vivo.

Inizialmente cellule condroprogenitrici umane (hCCs) di origine fetale vengono proposte come fonte di cellule disponibili senza la necessità di una biopsia del paziente. Gli hCCs, i condrociti adulti e le cellule staminali vengono confrontate tra di loro usando una matrice di collagene simile a quella usata in sala operatoria. Il potenziale dei vari tipi di cellule viene valutato in vitro in base alla loro capacità condrogenica, stabilità fenotipica e possibilità di vascolarizzazione. Dopo aver dimostrato una superiorità in termini di differenziazione cartilaginea, gli hCCs hanno dimostrato resistenza alla mineralizzazione e alla vascolarizzazione, ritenzione di matrice cartilaginea e produzione di nuova matrice in un modello murino sottocutaneo.

Quindi un nuovo idrogelo viene studiato per il suo potenziale utilizzo in applicazioni di ingegneria tissutale. L’HA-TG è stato sintetizzato funzionalizzando acido ialuronico (HA) ad alto peso molecolare con peptidi che possono essere gelificati con una transglutaminase (TG). Grazie alla possibilità di essere applicato mediante artroscopia, alla rapida gelificazione e alla forte adesività verso la cartilagine nativa, l’HA-TG viene dimostrato essere un valido biomateriale per l’ingegneria cartilaginea. Nel capitolo 3 viene studiata la capacità dell’HA-TG di indurre la proliferazione e la differenziazione condrogenica degli hCCs. Nel capitolo 4 viene testata la combinazione di HA-TG con sia condrociti auricolari (hAUR) che con gli hCCs in diversi modelli murini con differenti background immunitari. La resistenza all’infiltrazione cellulare ospite, così come la capacità condroinduttiva dell’HA-TG viene provata in animali totalmente immunocompromessi (NSG), atimici (nudi), umanizzati (NSG-SGM3) e immunocompetenti (C5BL/6).

Nel capitolo 5 viene proposto un ulteriore tipo di cellule per approcci clinici di ingegneria della cartilagine:​ i condrociti infantili da polidattilia. Grazie alla loro origine, i condrociti infantili sono superiori agli hCCs fetali in quanto non sono associati a limitazioni di natura etica. I condrociti infantili da polidattilia vengono esaustivamente caratterizzati in vitro in base ai loro profili di de-differenziazione e ri-differenziazione in 2D and in 3D (sia in un modello di pellet centrifugati che in HA-TG). In questo capitolo viene inoltre introdotta la possibilità di funzionalizzare l’HA-TG con eparina così da permettere la somministrazione del fattore di crescita TGF-β1 in situ. Quindi, la potenzialità dei condrociti infantili per terapie di ingegneria della cartilagine viene dimostrata in vitro, ex vivo e in vivo in un modello murino sottocutaneo.

Infine l’HA-TG viene testato in un modello ovino con rilevanza clinica. Infatti, difetti alla cartilagine a pieno spessore vengono trattati con HA-TG sia acellulare che cellulare e sia con somministrazione di TGF-β1 che senza. Essendo gli studi preclinici in modelli animali grandi uno step fondamentale per la traduzione clinica di nuove terapie di ingegneria della cartilagine articolare, questo capitolo rappresenta un passo fondamentale verso l’utilizzo dell’HA-TG nelle sale operatorie.

Per concludere, questa tesi illustra le potenzialità di due tipi di cellule alternative (cellule condroprogenitrici fetali e condrociti infantili da polidattilia) e di un nuovo biomateriale (HA-TG) per l’ingegneria della cartilagine articolare, contribuendo allo sviluppo di nuovi trattamenti per la riparazione di lesioni cartilaginee.