The prevalence of joint pain‐related disability results in a substantial socioeconomic burden on today’s society. Injury or degeneration of the cartilaginous surfaces on diarthrodial bones do not self‐heal due to lack of access to blood vessels and the body’s endogenous wound healing mechanisms. A myriad of different surgical procedures have been administered to patients suffering from joint pain, but none have been identified which guarantees full recovery of damaged cartilage with many patients suffering re‐ injury and requiring further treatment. Cell‐based therapies offer strong promise to fully restore cartilage function and meet these clinical demands. Ideally, autologous cells are harvested from the patient and implanted at the site of injury within a biomimetic matrix that instructs cells to synthesize and maintain cartilage‐specific tissue. Mesenchymal stem cells (MSCs) are widely considered an ideal cell type for cartilage cell‐based therapies due to their ready availability. Identifying appropriate culture conditions for reproducibly directing MSC chondrogenesis is key to unlocking their potential for cell‐based regenerative medicine therapy. The standard method for doing so involves culturing MSCs as centrifuged pellets in defined induction media, but this approach is highly variable and often fails to promote cartilage‐specific matrix production for some MSC donors.
The aim of this thesis was to engineer a system for enhancing MSC chondrogenesis that could overcome a number of limitations associated with micromass pellet culture, the conventional chondroinduction technique. Polysaccharides that are either present in cartilage extracellular matrix (ECM), or share structuralsimilarities to those that are present, were chemically modified to yield reactive groups that undergo Schiff base crosslinking under physiological reaction conditions. Conditions were then optimized for utilizing the modified polysaccharides to induce the aggregation of MSCs into condensation‐like engineered microtissues (EMTs) as a result of the rapid 30 minute Schiff base crosslinking reaction. Quantitative and histological comparisons of cartilage‐specific matrix production between EMTs and micromass pellets obtained by centrifugation revealed that the polysaccharide matrix in the EMT structure provided better conditions for elevating levels of MSC chondrogenesis. In follow‐up studies, we showed EMT culture could restore the chondrogenic potential of MSCs from aged donors that failed to differentiate when cultured as micromass pellets.
Next, the EMT method was further developed to allow for in situ differentiation of entrapped MSCs which would significantly decrease the amount of in vitro manipulation required for preparation as a surgical treatment option for cartilage defects. This was achieved by loading the critical chondrogenic induction factor, transforming growth factor‐beta 3 (TGF‐β3), into the polysaccharide network at the time of crosslinking. Release was monitored by ELISA and the optimal dose per microtissue was determined by quantitative assays and immunohistochemistry for driving MSC chondrogenesis during culture of samples in media that was not supplemented with TGF‐β3. Finally, the clinical merit of the EMT‐based method for treating cartilage defects was demonstrated in an in vitro repair assay. After 4 weeks culture in serum‐ free media that was not supplemented with the growth factor, cartilage defects seeded with EMTs loaded with TGF‐β3 yielded de novo repair tissue containing GAGs and type II collagen within the injury site.
The versatility of using Schiff base crosslinking for tissue engineering applications was demonstrated in a number of additional studies. Relating to cell‐based therapies for cartilage repair, the same modified polysaccharides used for EMTs were shown to improve the adhesion of cells to cartilage surfaces in a spatially controlled manner. Cartilages surfaces were rendered reactive for Schiff base crosslinking after brief incubation with sodium periodate, and cellssuspended in a polysaccharide solution containing free primary amines were selectively crosslinked to the tissue surface. In another application of Schiff base crosslinking for engineering microtissues, the 3D distribution of different cell populations could be controlled by sequential deposition of cells. Using this technique, complex co‐culture studies can be envisioned providing high degree of control for the spatial organization of the different cell types. To test the ability for supporting other cell types by EMT culture, a study was performed with primary hepatocytes. Hepatocyte microtissue formation was enhanced in EMTs versus hanging drop culture. The gene expression of cyp3a13, a member of the cytochrome P450 enzyme family responsible for drug metabolism, was elevated in EMTs compared to in vivo expression levels after 1 week of culture.
This thesis details a systematic approach for designing a biomaterial‐based system for engineering multicellular tissue structures. Schiff base crosslinking of modified polysaccharides was proven to serve 3 main functions: 1) rapid assembly of cells to either induce aggregation for formation of microtissues or to control adhesion of cells to tissue surfaces, 2) to determine optimal conditions for maintaining biological functionality in high‐density microtissues, and 3) for the loading and release of growth factors towards potential in vivo applications for directing cell differentiation in situ
Die weite Verbreitung der degenerativen Gelenkerkrankung ist eine hohe sozio‐ökonomische Last für die heutige Gesellschaft. Verletzter oder degenerierter Knorpel kann aufgrund des fehlenden Zugangs zur Blutzirkulation und dem körpereigenen Wundheilsystem nicht selbst regeneriert werden. Unzählige verschiedene chirurgische Eingriffe sind an Patienten mit Gelenkschmerzen durchgeführt worden, jedoch konnte bis heute keine Technik etabliert werden, welche zur vollen Regeneration des zerstörten Knorpels führt. Zell‐basierte Therapien sind äusserst vielversprechend, um diese klinischen Anforderungen zu erfüllen. Im Idealfall werden dafür autologe Zellen des Patienten gewonnen und direkt in einer biomimetischen Matrix, welche die Zellen zur Synthese und Aufrechterhaltung der Knorpelmatrix anregt, in den Defekt implantiert. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind weithin als idealer Zelltyp für eine zellbasierte Technik angesehen. Die Lenkung ihrer Differenzierung Richtung Chondrogenese ist jedoch nicht unproblematisch.
Das Ziel diese Doktorarbeit war die Entwicklung eines System zur verbesserten MSC Chondrogenese, welches einige Einschränkungen der konventionellen Chondro‐Induktionstechnik, der sogenannten Pellet‐Kultur, beseitigt. Polysaccharide, die entweder Teil der Knorpelmatrix sind oder strukturelle Ähnlichkeitzu ihr aufweisen, wurden chemisch modifiziert, um reaktive Aminogruppen für die Bildung von Schiff’schen Basen unter physiologischen Konditionen zu erhalten. Die Parameter der Vernetzungsreaktion wurden danach optimiert, um die Aggregation der MSCs in ein kondensationsähnliches Mikrogewebe (EMTs – condensation‐like engineered microtissue) in schnellen 30 Minuten zu induzieren. Quantitative und histologische Vergleiche der knorpelspezifischen Matrixproduktion zwischen EMTs und der durch Zentrifugation geformten Pellet‐Kulturen, zeigte die Fähigkeit der EMTs Polysaccharid‐Matrix zur verbesserten MSC Chondrogenese. Folgestudien zeigten, dass MSCs von älteren Patienten in EMT‐Kulturen zur Knorpelbildung angeregt werden konnten, während in Pellet‐Kulturen jegliche Matrixproduktion fehlgeschlagen war.
Als nächstes wurde die EMT Methode Richtung in situ Differenzierung weiterentwickelt, welche eine signifikante Reduzierung der nötigen pre‐operativen in vitro Manipulation ermöglicht. Der notwendige chondrogene Induktionsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor beta 3 (transforming growth factor‐beta 3 ‐ TGF‐β3), wurde dafür während der Vernetzung des Polysaccharidnetzwerkes direkt eingebunden. Die Abgabe des gebundenen TGF‐β3 wurde durch ELISA gemessen und quantitative Analysen und Immunohistochemie erlaubten die Bestimmung der optimalen Dosis pro Mikrogewebe, welches zur MSC Chondrogenese in TGF‐β3‐freiem Medium führt. Als letztes Experiment wurde die klinische Relevanz der EMT‐basierten Methode für die Behandlung von Knorpeldefekten in einem in vitro Reparaturtest analysiert. TGF‐beta beladene EMTs zeigten nach vierwöchiger Kultivierung in Serum‐freien Medium ohne Zugabe von Wachstumsfaktoren die Produktion von de novo Reparaturgewebe mit GAGs und Collagen 2.
Die vielfältige Anwendung der Schiff‐Basen Vernetzung auf dem Gebiet des Tissue‐Engineering wurde in verschiedenen zusätzlichen Studien gezeigt. Im Bezug auf zellbasierende Therapien auf dem Gebiet der Knorpelregeneration haben die modifizierten Polysaccharide, welche erfolgreich in EMTs angewendet wurden, auch ihre Fähigkeit zur räumlich‐definierten Erhöhung der Zelladhäsion auf der Knorpeloberfläche gezeigt. Die Knorpeloberfläche wurde durch eine kurze Inkubation mit Natriumperiodat für die Schiff‐Basen Reaktion aktiviert und die Zellen gemischt in Polysacchariden anhand der freien primären Amine selektiv an die Gewebeoberfläche gebunden. Eine weitere Anwendung der Schiff‐Basen Reaktion auf dem Gebiet der Mikrogewebeproduktion ist die räumliche Verteilung von verschiedenen Zelltypen, welche durch ihre sequentielle Ablage kontrolliert werden kann. Diese Technik bildet die Grundlage für mögliche Co‐Kultur Studien mit komplexer und hoch definierter Struktur. Eine weitere Studie hat anhand von primären Hepatozyten das Potential der EMT Kultivierung für andere Zelltypen analysiert. Die Mikrogewebebildung von Hepatozyten wurde in EMTs verglichen zur Kultivierung in hängenden Tropfen stärker unterstützt. Die Genexpression von cyp3a13, ein Mitglied der Cytochrome P450 Enzymfamilie und verantwortlich für den Wirkstoffmetabolismus, übertraf in EMTs nach einer Woche das Niveau der in vivo Expression.
Diese Doktorarbeit beschreibt eine systematische Herangehensweise zum Design eines Biomaterial‐basierenden Systems für die Herstellung von multi‐zellulären Gewebestrukturen. Die Schiff‐ Basen Vernetzung von modifizierten Polysacchariden konnte für folgende 3 Hauptfunktionen erfolgreich etabliert werden: 1) schneller Aufbau eines Zellverbandes um entweder die Zellaggregation für Mikrogewebe zu induzieren oder die Zelladhäsion zu Gewebeoberflächen zu kontrollieren, 2) Formierung von hoch‐Dichte Zellstrukturen, welche die biologischen Funktionen aufrechterhalten, und 3) die Bindung und Abgabe von Wachstumsfaktoren um exzessive in vitro Manipulation zu eliminieren.