Osteoarthritis (OA) is associated with tissue damage and loss of function, which can be observed in preclinical studies using micro-computed tomography (microCT). MicroCT has been used to obtain and evaluate structural changes in the knee joint of OA models via bone morphometric analysis. However, bone morphometric analysis has yet to be used to evaluate early structural changes in a collagenase-induced OA mouse model at multiple time points. In this model, an acute inflammatory response starts immediately;​ however, the onset and progression of structural changes have not been fully described. Some of these changes are related to the osteochondral interface.

The osteochondral interface is a transitional zone anchoring articular cartilage to subchondral bone. It has been shown that during OA, increased neoangiogenesis creates porous channels in this zone, allowing the transport of molecules linked to OA development. Importantly, the connection between these porous channels and the early stages of OA development is still not fully understood. While standard microCT is usually able to image and distinguish mineralised tissues (such as cortical bone), it is not enough to differentiate between unmineralised tissues (such as articular cartilage and surrounding soft tissues or the osteochondral interface). Therefore, a contrast agent is necessary to image the porous channels at the osteochondral interface and distinguish the different tissues (both mineralised and unmineralised) in this region.

Thus, the aim of this doctorate work was to develop robust protocols and tools for acquiring accurate joint mechanobiological measurements with contrast-enhanced microCT. In order to develop this, three specific aims to be addressed in this work were formulated, namely;​

1. Evaluate early structural changes in the knee joint over time in a collagenaseinduced OA mouse model with microCT,
2. Synthesise and optimise a lanthanide-based microCT contrast agent and evaluate it in sintered porous channel models and in mouse subchondral bone,
3. Couple the optimised lanthanide nanoparticles with dextran as a biocompatible tracer and evaluate their cytotoxicity.

In response to these aims, this thesis implements a multidisciplinary approach focused on investigating creative methods to further investigate OA progression in the osteochondral interface with microCT. First, multiple structural parameters in the collagenase-induced OA mouse model were obtained from two subchondral bone compartments, e.g., cortical, and epiphyseal trabecular bone. Statistically significant differences between OA and control samples were observed since early disease progression stages in several bone morphometric measures, e.g., bone volume (BV), bone volume density (BV/TV), trabecular thickness (Tb.Th), trabecular separation (Tb.Sp), trabecular number (Tb.N), cortical thickness (Ct.Th) and cortical porosity (Ct.Po). These findings showed that bone remodelling activity occurs simultaneously with the acute inflammatory response in this model. These findings also stimulated further investigation of early structural changes occurring specifically in the osteochondral interface.

Due to the interconnected nature of the osteochondral interface, the following aim was to explore the optimisation of nanoparticle-based microCT contrast agents for potentially imaging the porous channels at the osteochondral interface. BaYbF5 nanoparticles were synthesised and coated with a biocompatible silica shell (SiO2), generating an optimised microCT contrast agent in order to obtain an appropriate contrast attenuation for subsequent segmentation of structures of interest (i.e., porous channel models and subchondral bone). For this purpose, a proof-of-concept was successfully demonstrated in porous channel models and mouse subchondral bone, in which the optimised nanoparticles successfully increased their X-ray attenuation.

Finally, this work describes a series of chemical reactions to couple the optimised nanoparticles with a biocompatible tracer, dextran, that can be transported via the vascular system and then diffuse through the osteochondral interface. These reactions generated a novel compound, NP-Dextran, able to provide efficient contrast in microCT and potentially target the osteochondral interface in animal studies. Extensive characterisation techniques were performed to evaluate the NP-Dextran chemical structure. Further, an in vitro toxicity test demonstrated the low toxicity of the novel compound NP-Dextran, evidencing a high potential for its use in vivo animal experiments for further investigating OA progression.

A osteoartrite (OA) está associada a danos nos tecidos e perda de função, que podem ser observados em estudos pré-clínicos usando micro tomografia computadorizada (microCT). MicroCT tem sido usado para obter mudanças estruturais na articulação do joelho em modelos de OA por meio de análise morfométrica quantitativa (QMA). No entanto, QMA ainda não foi usado para avaliar as mudanças estruturais em estágios iniciais da doença em camundongos experimentais em que OA é induzida por colagenase. Nesse animal experimental, uma resposta inflamatória aguda começa imediatamente;​ no entanto, o início e a progressão das mudanças estruturais não foram ainda totalmente descritos.

Foi demonstrado que durante OA, o aumento da neoangiogênese cria canais porosos na interface osteocondral, uma zona de transição que ancora a cartilagem articular ao osso subcondral, permitindo o transporte de moléculas ligadas ao desenvolvimento de OA. É importante ressaltar que a conexão entre esses canais porosos e os estágios iniciais do desenvolvimento de OA ainda não é totalmente compreendida. MicroCT oferece a capacidade de obter imagens dos canais porosos na interface osteocondral, no entanto, um agente de contraste é necessário para delinear as diferentes atenuações de raios-X dos tecidos.

Assim, o objetivo deste trabalho de doutorado foi desenvolver protocolos e ferramentas robustas para a aquisição de medidas mecanobiológicas articulares precisas com microCT. Para o desenvolver, foram formulados três objetivos específicos a abordar neste trabalho, a saber;​

1. Avaliar as mudanças estruturais nas juntas no estágio inicial da doença em camundongos experimentais com OA induzida por collagenase usando microCT,
2. Sintetizar e otimizar um agente de contraste feito com nanopartículas para imagem com microCT à base de lantanídeos e avaliá-lo em modelos de canais porosos sinterizados e em osso subcondral de camundongos experimentais,
3. Acoplar as nanopartículas de lantanídeos otimizadas com dextrano como marcador biocompatível e avaliar sua toxicidade.

Em resposta a esses objetivos, esta tese implementa uma abordagem multidisciplinar com foco na investigação de métodos criativos para investigar a progressão da OA com microCT. Em primeiro lugar, múltiplos parâmetros estruturais nos camundongos experimentais com OA induzida por colagenase foram obtidos a partir de dois compartimentos ósseos, cortical e trabecular epifisário. Diferenças estatisticamente significativas entre OA e amostras de controle foram observadas desde os estágios iniciais da progressão da doença em várias parâmetros morfométricos ósseos, por exemplo, volume ósseo (BV), densidade do volume ósseo (BV / TV), espessura trabecular (Tb.Th), espaço trabecular (Tb .Sp), número trabecular (Tb.N), espessura cortical (Ct.Th) e porosidade cortical (Ct.Po). Esses resultados evidenciaram que a atividade de remodelação óssea ocorre simultaneamente com a resposta inflamatória aguda neste modelo experimental de OA. Eles também estimularam a investigação das mudanças estruturais iniciais que ocorrem especificamente na interface osteocondral.

Devido à natureza interconectada da interface osteocondral, o objetivo a seguir foi explorar a otimização de agentes de contraste microCT baseados em nanopartículas para canais porosos para permitir coletar imagens da interface osteocondral usando microCT. Nanopartículas de BaYbF5 foram sintetizadas e revestidas com uma casca de sílica biocompatível (SiO2), gerando um agente de contraste microCT otimizado a fim de obter uma atenuação de contraste adequada para posterior segmentação das estruturas de interesse. Para tanto, a prova de conceito foi demonstrada com sucesso em modelos de canais porosos e osso subcondral de camundongos, nos quais as nanopartículas otimizadas aumentaram com sucesso a atenuação de raios-X.

Finalmente, este trabalho detalhou uma série de reações químicas para acoplar as nanopartículas otimizadas com um traçador biocompatível, dextran, que pode ser transportado via sistema vascular e então difundir através da interface osteocondral. Essas reações geraram um novo composto, NP-Dextran, capaz de fornecer contraste eficiente em microCT e potencialmente difundir até a interface osteocondral em estudos com camundongos experimentais. Extensas técnicas de caracterização foram realizadas para avaliar a estrutura do NP-Dextran. Isso incluiu um teste de toxicidade que demonstrou a baixa toxicidade in vitro do novo composto NP-Dextran, evidenciando um alto potencial para seu uso em experimentos com camundongs in vivo para investigar ainda mais a progressão da OA futuramente.