The capability to fabricate biomimetic scaffolds that closely resemble a host's tissue environment is critical for the success of tissue engineering. In order to recapitulate the complexity of native tissues, the chemical, mechanical, and biological characteristics of the scaffold must be considered. Indeed, it appears that providing suitable mechanical and biological signals to the cells is key to promoting tissue regeneration. Furthermore, due to the complex hierarchical organization and length scales of human tissues, the choice of biofabrication technique, or set of techniques, is critical for the formation of functional tissues. With the advancement in additive manufacturing technologies, novel techniques and materials are rapidly emerging to produce highly biocompatible and biomimetic 3D scaffolds. Additive manufacturing techniques have given birth to a new branch of personalized medical care, where starting from CT scans, it is now possible to manufacture patient-specific implants with high resolution and better host integration. In the future, these implants will contain living cells which will contribute to tissue regeneration.
This thesis focuses on the development of advanced additive manufacturing strategies for the fabrication of patient-specific implants. For this purpose, four main topics have been studied. In the first study, we focused on the development of flexible metallic reinforcement strategies to support hydrogel constructs. This was achieved by creating a library of semi-flexible titanium lattices which could be used to reinforce soft, cell-laden hydrogels. In this study, titanium lattices provided additional mechanical stability to the embedded viscoelastic agarose hydrogels. As a proof of concept, an intervertebral spinal disc implant was designed which had compressive moduli in the range of native human nucleus pulposus and anulus fibrosus.
In the second study, we aimed at developing a personalized and flexible wireframe to improve upon the current clinical procedures used in ear reconstruction. Firstly, a statistical shape model (SSM) of the ear was developed using head CT images from 100 subjects. This SSM allowed the calculation of both a statistically ‘average’ human ear as well as captured variation modes encompassing the entire range of human ear anatomical variation. Using data from literature, the SSM was further developed to estimate the shape and thickness of the underlying cartilaginous structure. Finally, a wireframe was designed to capture the external anatomy of a subject’s ear when placed under his or her skin. The flexible Ti-6Al-4V wireframe implants were 3D printed and implanted subcutaneously in nude rats. The implanted wireframe allowed for excellent aesthetic reconstruction of the human auricular shape, which was retained over the time of implantation in vivo.
In the third study, we studied the use of a biodegradable polymer in providing mechanical support to soft, cell-laden hydrogel constructs. The polymer was 3D printed using fused deposition modelling and embedded in an enzymatically-crosslinked hyaluronan hydrogel, together with human epiphyseal chondroprogenitors. The degradation of the lactide copolymer was compensated for by the stiffening of the hydrogel component, as the cells secreted increasing amounts of extracellular matrix. The maturation of the reinforced construct was evaluated over the course of 63 days, showing excellent cell viability and glycosaminoglycan and collagen II deposition.
In the final study, we explored new techniques to improve shape retention of soft and mechanically unstable hydrogels. A novel biofabrication technique termed ‘alginate shells’ is presented for the casting of soft hydrogels. Cell-laden materials were enclosed within a thin, semi-permeable hydrogel shell that retains the desired shape while still allowing for the diffusion of nutrients and gasses needed for optimal cell proliferation. The thickness of the alginate shells was tuned by controlling the length of exposure to an ion-eluting mold. The semi-permeable alginate shell allowed the development and maturation of cell-laden soft hydrogels in complex and biologically relevant shapes without need for additional components or support materials.
Overall, this thesis makes important steps towards bridging the gap between established clinical techniques for the treatment of craniofacial and skeletal deformities and the state-of-the-art tissue engineering techniques developed in academic settings. The feasibility of different biofabrication approaches for the regeneration of auricular and articular cartilage are described, as well as the realization of flexible patient specific implants which can serve as a true alternative to conventional ear reconstruction surgery.
Scopo del presente lavoro è di ricercare nuovi approcci per la rigenerazione di cartilagine e la realizzazione di impianti craniofacciali come alternativa alla chirurgia tradizionale della ricostruzione dell’orecchio.
Alla compiuta realizzazione dei principi dell’ingegneria tissutale concorre in modo determinante la capacità di fabbricare scaffold biomimetici che assomiglino ai tessuti del paziente. I complessi tessuti umani vengono riprodotti in laboratorio tenendo in considerazione le caratteristiche chimiche, meccaniche e biologiche degli scaffold. La rigenerazione di tessuti è promossa allorché siano forniti alle cellule adeguati segnali meccanici e biologici. Inoltre, a causa della complessa organizzazione gerarchica e delle scale di lunghezza dei tessuti dell’uomo, la scelta di una o più tecniche di biofabbricazione è fondamentale per la formazione dei tessuti funzionali. Con il progresso delle tecnologie di produzione additiva, stanno rapidamente sviluppandosi nuove tecniche e materiali per produrre scaffold 3D altamente biocompatibili e biomimetici. Le tecniche di produzione additiva hanno dato vita a una nuova branca della medicina personalizzata che, partendo da scansioni di tomografia assiale computerizzata (TAC), producono impianti specifici ad alta risoluzione e con una migliore integrazione nel paziente. In futuro, questi impianti conterranno cellule viventi che contribuiranno alla rigenerazione dei tessuti.
La ricerca si è focalizzata sullo sviluppo di strategie avanzate di produzione tessutale additiva per la fabbricazione di impianti specifici. A tal fine sono stati studiati quattro aspetti principali. Il primo studio illustra lo sviluppo di strategie di scaffold metallici flessibili per rinforzare gli idrogeli. Ciò è stato ottenuto creando una libreria di strutture in titanio semiflessibili che possono essere utilizzati per rinforzare idrogel contenenti cellule. Le strutture di titanio hanno fornito ulteriore stabilità meccanica all’idrogel di agarosio conservando le sue properietà viscoelastiche. Come prova di fattibilità è stato progettato un impianto di disco spinale intervertebrale con proprietà meccaniche comparabili a quelle del nucleus pulposus e anulus fibrosus dei dischi intervertebrali.
Il secondo studio è finalizzato allo sviluppo di un wireframe personalizzato e flessibile per migliorare le attuali procedure cliniche utilizzate nella ricostruzione dell’orecchio. In primo luogo, è stato sviluppato un modello statistico di forma dell’orecchio (statistical shape model, SSM) utilizzando le immagini provenienti dalle TAC della testa di cento pazienti. Tale SSM ha consentito di generare una forma di orecchio da considerare statisticamente “modello medio” e di comprendere allo stesso tempo l’intera gamma di variazioni anatomiche dell’orecchio umano. Utilizzando dati in letteratura, l’SSM è stato ulteriormente sviluppato per stimare la forma e lo spessore della struttura cartilaginea sottostante. È quindi seguita la progettazione di un wireframe sotto lo strato di pelle per riprodurre l’anatomia esterna dell’orecchio di un paziente. I wireframe flessibili sono stati stampati in modo additivo utilizzando titanio (Ti-6Al-4V) e impiantati sottocute in ratti. Il wireframe impiantato ha dimostrato un’eccellente ricostruzione estetica della forma auricolare umana che è stata mantenuta intatta per tutta la durata dell’esperimento.
Il terzo studio è incentrato sull’utilizzazione di un polimero biodegradabile per fornire supporto meccanico a idrogeli morbidi contenenti cellule. Il polimero è stato stampato in 3D utilizzando la modellazione a deposizione fusa (fused deposition modelling, FDM) e incorporato in un idrogel ialuronico reticolato enzimaticamente insieme a cellule condroprogenitrici umane. La degradazione del copolimero lattide è stata compensata dall’irrigidimento dell’idrogel poiché le cellule hanno secreto una quantità crescente di matrice extracellulare. La maturazione del costrutto rinforzato è stata valutata nel corso di 63 giorni mostrando un’eccellente vitalità cellulare e deposizione di glicosaminoglicani e collagene II.
Nell’ultimo studio sono infine esplorate nuove tecniche per migliorare il mantenimento della forma di idrogeli morbidi e meccanicamente instabili: viene presentata qui una nuova tecnica di biofabbricazione denominata “gusci di alginato” (alginate shells) per il casting di idrogeli morbidi. I materiali contenti cellule sono stati racchiusi all’interno di un guscio di idrogel sottile e semipermeabile che mantiene la forma desiderata pur consentendo la diffusione di nutrienti e dei gas necessari per una proliferazione cellulare ottimale. Lo spessore dei gusci di alginato è stato colato in uno stampo costituito da un termopolimero in grado di eluire ioni e perciò controllare lo spessore dei gusci. Il guscio di alginato semipermeabile ha consentito lo sviluppo e la maturazione di idrogeli morbidi contenenti cellule in forme complesse e biologicamente rilevanti senza la necessità di componenti aggiuntivi o materiali di supporto.
La tesi, attraverso la descrizione di tecniche di biofabbricazione per la rigenerazione della cartilagine auricolare e articolare e la realizzazione di impianti flessibili specifici, non esaurisce la ricerca del processo di duplicazione di tessuti in continuo sviluppo, ma fornisce un contributo alle tecniche cliniche consolidate per il trattamento delle deformità craniofacciali e a quelle di ingegneria tissutale sviluppate in contesti accademici.