Athletes' skeletons get stronger with training, while bones weaken in people who cannot move or in astronauts experiencing weightlessness. These changes are mediated by bone cells which can perceive mechanical forces, convert them to biochemical signals and induce changes in bone mass and strength. Among the first detectable signals following mechanical stimulation is the release of the energy-rich molecule ATP. Extracellular ATP was proposed as a mechanotransductive signaling molecular over 20 years ago and has been shown to signal through 15 different purinergic receptors (P2). However, the exact contribution of ATP release and P2 signaling to mechanicallyinduced bone adaptation remains unclear. The primary aims of this dissertation were to investigate the mechanisms of mechanically-stimulated ATP release from bone cells and to determine how the purinergic signal transmits information about the nature of the mechanical stimulus to neighbouring cells.

Many studies examining the mechanisms of mechanically-stimulated ATP release have been conducted to date. Since large-scale quantitative synthesis of basic research has not been attempted, I developed the theoretical foundation, computational resources and workflow required to conduct a meta-analysis in the basic sciences. This enabled consolidation and synthesis of quantitative data from 278 studies that investigated the amount, kinetics and mechanisms of ATP release, as well as the influence of pathologies on ATP release. I demonstrated that mechanicallystimulated ATP release is a conserved phenomenon across mammalian cells, and that mechanically-stimulated cells release 38.6 (95% confidence interval [CI]:​ 18.2 to 81.8) amoles ATP/cell on average with a characteristic time constant of 32 s (95% CI:​ 16 to 66). Importantly, vesicles and voltage sensitive calcium channels (VSCCs) were implicated in the release of ATP from mechanically-stimulated osteoblasts and osteocytes.

I next investigated the mechanisms of ATP release from osteoblasts experimentally. However, since mechanically-stimulated ATP release and ATP-mediated P2 responses are calcium-dependent processes, it was pertinent to establish a protocol for large-scale analysis of calcium responses. To do this, we developed a calcium-signal processing algorithm capable of characterizing calcium signatures, thereby automating and standardizing the analysis process.

I determined that mechanical stimulation of a single murine osteoblast led to the release of 70 ± 24 amole ATP, which stimulated calcium responses in neighboring cells. Osteoblasts were found to contain ATP-rich vesicles that were released upon mechanical stimulation, however, pharmacological interventions that promoted vesicular exocytosis reduced ATP release, while inhibitors of vesicular release potentiated ATP release. In search of an alternative route of ATP release, I found that mechanical stresses induced reversible cell membrane injury in vitro and in vivo. Calcium/PKC-dependent vesicular exocytosis facilitated membrane repair, thereby ensuring cell viability and reducing ATP release. Thus, I propose that exocytosis of ATP-containing vesicles limits the much larger efflux of intracellular ATP through reversibly damaged membranes by facilitating membrane repair. To reconcile our findings with prior work, I suggest that non-lytic routes of ATP release predominate in basal and low mechanical agitation conditions, while injury-related ATP release becomes prevalent only when the stimulus surpasses a certain threshold.

To understand how the purinergic signal conveys information about the mechanical stimulus to neighbouring bone cells, I developed a mathematical model describing injury-related ATP and ADP release, extracellular diffusion and degradation, and purinergic responses. The model was validated using experimental data obtained by mechanically-stimulating a single osteoblast and measuring ATP release, membrane repair and calcium signaling in neighboring cells. I found that the total amount of ATP released, peak extracellular ATP concentration and the ADP-mediated signaling component contributed complementary information regarding the mechanical stimulation event. Specifically, the total amount of ATP released determined the maximal distance from the injury at which purinergic responses were stimulated, as well as the overall number of responders. Peak ATP concentrations allowed cells to discriminate between minor and severe injuries that led to the release of similar amounts of ATP due to different injury repair kinetics. ADP-mediated signaling became relevant in larger tissue-level injuries, conveying information about the distance to the injury site and its geometry. Therefore, mechanotransductive purinergic signalling fields are tuned by the severity of injury and dynamics of repair, thereby enabling neighbouring cellular populations to evoke position- and injury-appropriate responses.

Overall, the studies presented in this dissertation demonstrate that (i) bone cell injury is critical for purinergic mechanotransduction, (ii) membrane repair occurs through calcium/PKC-dependent vesicular exocytosis, and (iii) information about the severity of injury and cellular mechano-adaptive status is integrated at the level of the purinergic signal that communicates mechanical information to neighbouring cells. Importantly, identification of molecular mediators, including PKCµ, may represent future therapeutic targets in prevention of disuse-related bone loss.

Les squelettes des athlètes deviennent plus forts à l'entraînement, tandis que les os s'affaiblissent chez les personnes qui ne peuvent pas bouger ou chez les astronautes en apesanteur. Ces changements sont médiés par les cellules osseuses qui peuvent percevoir les forces mécaniques, les convertir en signaux biochimiques et induire des changements dans la masse et la force osseuses. Parmi les premiers signaux détectables à la suite d'une stimulation mécanique figure la libération d'une molécule riche en énergie, l'ATP. L'ATP extracellulaire a été proposé comme molécule de signalisation mécanotransductive il y a plus de 20 ans et il a été démontré qu'il est signalé par 15 récepteurs purinergiques différents (P2). Cependant, la contribution exacte de la libération d'ATP et de la signalisation P2 à l'adaptation osseuse induite mécaniquement demeure incertaine. Les principaux objectifs de cette thèse étaient d'étudier les mécanismes de la libération d'ATP stimulée mécaniquement par les cellules osseuses et de déterminer comment le signal purinergique transmet l'information selon la nature du stimulus mécanique aux cellules voisines.

De nombreuses études portant sur les mécanismes de libération d'ATP stimulée mécaniquement ont été menées à ce jour. Comme aucune synthèse quantitative à grande échelle de la recherche fondamentale n'a été entreprise, j'ai mis au point les bases théoriques, les ressources informatiques et le déroulement du travail nécessaires pour effectuer une méta-analyse en sciences fondamentales. Cela a permis de consolider et de synthétiser les données quantitatives de 278 études portant sur la quantité, la cinétique et les mécanismes de libération de l'ATP, ainsi que l'influence des pathologies sur la libération de l'ATP. J'ai démontré que la libération d'ATP stimulée mécaniquement est un phénomène conservé dans les cellules de mammifères, et que les cellules stimulées mécaniquement libèrent 38,6 (intervalle de confiance à 95 % [IC]:​ 18,2 à 81,8) amoles ATP/cellule en moyenne avec une constante de temps caractéristique de 32 s (IC 95 %:​ 16 à 66). Il est important de noter que les vésicules et les canaux calciques sensibles au voltage (VSCC) ont été impliqués dans la libération d'ATP des ostéoblastes et ostéocytes stimulés mécaniquement.

J'ai ensuite étudié expérimentalement les mécanismes de libération de l'ATP par les ostéoblastes. Toutefois, comme la libération d'ATP stimulée mécaniquement et les réponses P2 médiées par l'ATP sont des processus dépendant du calcium, il était pertinent d'établir un protocole pour une analyse à grande échelle des réponses calciques. Pour ce faire, nous avons développé un algorithme de traitement des signaux calciques capable de caractériser les signatures calciques, automatisant et standardisant ainsi le processus d'analyse.

J'ai déterminé que la stimulation mécanique d'un seul ostéoblaste murin a conduit à la libération de 70 ± 24 amole ATP, qui stimulait les réponses calciques dans les cellules voisines. Les ostéoblastes contiennent des vésicules riches en ATP qui sont libérées par stimulation mécanique, mais les interventions pharmacologiques qui favorisent l'exocytose vésiculaire réduisent la libération d'ATP, tandis que les inhibiteurs de la libération vésiculaire potentialisent la libération d'ATP. À la recherche d'une autre voie de libération de l'ATP, j'ai découvert que les contraintes mécaniques provoquaient des lésions réversibles de la membrane cellulaire in vitro et in vivo. L'exocytose vésiculaire dépendante du calcium et du PKC a facilité la réparation de la membrane, assurant ainsi la viabilité cellulaire et réduisant la libération d'ATP. Ainsi, je propose que l'exocytose des vésicules contenant de l'ATP limite le flux beaucoup plus important d'ATP intracellulaire à travers les membranes endommagées de façon réversible en facilitant la réparation des membranes. Pour concilier nos constatations avec les travaux antérieurs, je suggère que les voies non électrolytiques de libération d'ATP prédominent dans les conditions d'agitation basale et de faible agitation mécanique, tandis que la libération d'ATP liée aux blessures ne devient prévalente que lorsque le stimulus dépasse un certain seuil.

Pour comprendre comment le signal purinergique transmet l'information sur le stimulus mécanique aux cellules osseuses voisines, j'ai mis au point un modèle mathématique décrivant la libération d'ATP et d'ADP liée à une lésion, la diffusion et la dégradation extracellulaires et les réactions purinergiques. Le modèle a été validé à l'aide de données expérimentales obtenues en stimulant mécaniquement un seul ostéoblaste et en mesurant la libération d'ATP, la réparation des membranes et la signalisation du calcium dans les cellules voisines. J'ai constaté que la quantité totale d'ATP libérée, la concentration maximale extracellulaire d'ATP et la composante de signalisation médiée par l'ADP ont fourni des renseignements complémentaires concernant l'événement de stimulation mécanique. Plus précisément, la quantité totale d'ATP libérée a déterminé la distance maximale de la blessure à laquelle les réponses purinergiques ont été stimulées, ainsi que le nombre total de répondants. Les concentrations maximales d'ATP ont permis aux cellules de faire la distinction entre les blessures mineures et les blessures graves, ce qui a entraîné la libération de quantités similaires d'ATP en raison de la cinétique de réparation différente des blessures. La signalisation médiée par l'ADP est devenue pertinente pour les lésions tissulaires de plus grande envergure, transmettant de l'information sur la distance jusqu'au site de la lésion et sur sa géométrie. Par conséquent, les champs de signalisation purinergiques mécanotransducteurs sont réglés en fonction de la gravité de la blessure et de la dynamique de réparation, ce qui permet aux populations cellulaires voisines d'évoquer des réponses adaptées à la position et à la blessure.

Dans l'ensemble, les études présentées dans cette thèse démontrent que (i) les lésions des cellules osseuses sont critiques pour la mécanotransduction purinergique, (ii) la réparation membranaire se produit par exocytose vésiculaire dépendante du calcium/PKC, et (iii) les informations sur la gravité des lésions et le statut mécano-adaptatif cellulaire sont intégrées au niveau du signal purinergique qui communique des informations mécaniques aux cellules voisines. Il est important de noter que l'identification des médiateurs moléculaires, y compris la PKCµ, pourrait représenter des cibles thérapeutiques futures dans la prévention de la perte osseuse liée à l'utilisation.