Tendon is a mechanosensitive tissue that performs a predominantly mechanical function by connecting muscle-to-bone or muscle-to-muscle. The extracellular matrix (ECM) plays a key role in maintaining the structural integrity of tendon, and in functionally transmitting physical forces across the musculoskeletal system. However, the role of ECM in tendons extends beyond passively providing structural support. Tendon homeostasis is greatly influenced by the ECM composition, stiffness, and organization, whereby tissue-resident cells continuously sense and balance these variables to maintain a steady state of tensional homeostasis. Furthermore, tendons have a compromised healing capacity and tend to repair by forming dysfunctional scars. In contrast, degenerative tendon pathologies are increasingly viewed as diseases of dysregulated tensional homeostasis. Chronic overuse injuries, for example, are thought to initiate a chain of aberrant matrix remodeling events that culminate in a tendon “matrix switch” dominated by the accumulation of collagen type III-rich niches. In this dissertation, we broadly hypothesized that chronic inflammation in tendinopathy is primarily an extracellular matrix-driven phenomenon by which ECM composition and/or stiffness precondition resident tendon-derived stromal cells towards a fibro-inflammatory activation trajectory.
By combining engineering principles and biomaterials approaches, we developed and used three mechano-culture systems to investigate the interplay between matrix tension and its biochemical composition in tendon, in a precise and controlled manner. First, we engineered a modular, cantileverbased mechano-culture platform that allowed us to easily vary the matrix static tension of tendon-like tissues mimetics. By decoupling matrix rigidity from bulk tissue properties, i.e., ECM ligands crosslinking density, we used this mechano-culture system to show that sustained mechanical tension dictates the persistence of pathological remodeling in models of tendon fibrosis. We further demonstrated that elevated matrix tension negatively correlates with the transcription of major fibrogenic collagens, departing from the established association between the two-dimensional matrix rigidity and upregulation of collagen expression. Next, we assessed the physiological and clinical relevance of these findings in models of systemic sclerosis (SSc). We biomechanically characterized the tendons of Fra2/Fosl2(Tg) overexpression mouse model which display a SSc-like inflammatory phenotype. We found that tendons of Fra2(Tg) mice exhibit dysregulated mechanical homeostasis, with approximately 23% average increase in tendon elastic modulus (E.) compared to wild-type controls. We then assessed the transcription of key matrisome collagens in these mice as well as in rare tendon specimens from a SSc autopsy.
Remarkably, we found that matrix stiffening also negatively correlated with the transcription of major pro-fibrotic collagens in the in vivo models of SSc. Collectively, this work established that fibrogenic remodeling is mechanically gated in tendon, and revealed that mechanical tension-regulated feedback loops are likely to be a central feature of tendon fibrosis in SSc.
In the second series of studies, we sought to modulate the cell length-scale homeostatic tension by varying the degree of matrix stiffness using two-dimensional planar substrates. We developed a tunable mechano-variant silicone-based platform with superior scalability and reproducibility. This platform allowed us to initiate human tendon-derived stromal fibroblasts cultures in vitro directly from freshly isolated cells without ever passaging the cells on the ultra-stiff tissue culture plastic (TCP). We used these mechano-variant substrates, together with RNA sequencing and bioinformatics, to map the systems-level, stiffness-sensitive responses of human tendon-derived stromal cells. We found that the matrix stiffness range that approximates tendon microscale stiffness (E. ~35 kPa) distinctly favored a tendon tissue-specific transcriptional signature, while abrogating the activation of pathways associated with aberrant tensional homeostasis. More specifically, tendon matrix-mimicking rigidities mediated transcriptional programs related chromatin remodeling and the mechano-responsive Hippo signaling pathway. In contrast, compliant stiffnesses (E. ~2 kPa) were enriched in processes related to pluripotency, synapse assembly and angiogenesis. Computational inference of upstream regulators predicted that ERK1/2 and AKT1 are major signaling hubs mediating stiffness-sensing in tendon cells. In sum, we profiled transcriptional mechano-responses of human tendon-derived stromal cells as a function of matrix rigidity. These findings illuminated how the matrix tensional mechano-reciprocity may regulate diverse sets of previously underappreciated mechanosensitive processes in tendon fibroblasts, and defined the range of E. ~35 kPa as a stiffness window that reinstates tendon tissue-specific transcriptomic signatures in vitro.
In the last chapter, we examined one of the long-standing unanswered questions in the tendon field: “What role does collagen type III play in tendon homeostasis and disease?” We harnessed the abovementioned in vitro mechano-culture models and further developed a three-dimensional hydrogel system that allowed us to adjust the pericellular matrix (PCM) stiffness independently of collagen ligand composition and architecture. We demonstrated that pericellular collagen type III and dysregulated matrix tension synergistically regulate pro-inflammatory activation and ECM remodeling phenotypes in tendon stromal cells. We uncovered that tendon cells sense pericellular collagen III via the adhesion G-protein-coupled receptor GPR56/ADGRG1.
Agonist activation of endogenous GPR56 elicited a transcriptional signature mirroring the collagen IIImediated phenotypes in 3D hydrogels niches, with many features suggestive of ECM remodeling and altered cell-ECM interactions and related cytoskeletal responses. Through gain-of-function and CRISPR-Cas9-mediated genetic ablation, these studies further revealed that GPR56 tunes PCM composition in tendon cells, likely through a RhoA-actomyosin mechano-signaling axis. Together, this body of work established that increased accumulation of type III collagen and its engagement with GPR56 alter tendon cell-ECM homeostatic balance by initiating distinct mechano-responsive intracellular signaling cascades. The findings highlight a potential major role for the collagen IIIspecific receptor, GPR56/ADGRG1, in sensing and integrating the pericellular cues in connective tissues.
Taken together, this dissertation deepens our fundamental understanding of the role of ECM mechanics and composition in regulating tendon tensional homeostasis in health and disease. More importantly, it unveiled a previously undescribed role of GPR56/ADGRG1 receptor as a “contextual mechanosensor”, opening new directions for exploring basic mechanosensory mechanisms in tendon and other connective tissues.
Die Sehne ist ein mechanosensitives Gewebe, das vor allem eine mechanische Funktion erfüllt, indem es Muskel und Knochen oder Muskel und Muskel miteinander verbindet. Die extrazelluläre Matrix (ECM) spielt eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Sehne und bei der funktionellen Übertragung von physischen Kräften über den gesamten Bewegungsapparat. Die Rolle der ECM in Sehnen geht jedoch über die passive Bereitstellung struktureller Unterstützung hinaus. Die Homöostase der Sehne wird in hohem Masse von der Zusammensetzung, der Steifigkeit und der Organisation der ECM beeinflusst, wobei die im Gewebe befindlichen Zellen diese Variablen kontinuierlich erfassen und ausgleichen, um einen stabilen Zustand der Spannung, die Spannungshomöostase, aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus haben Sehnen eine eingeschränkte Heilungsfähigkeit und neigen dazu, sich durch die Bildung dysfunktionaler Narben zu reparieren. Im Gegensatz dazu werden degenerative Sehnenpathologien zunehmend als Krankheiten angesehen, bei denen die Spannungshomöostase gestört ist. So wird beispielsweise angenommen, dass chronische Überbelastungsverletzungen eine Kette abnormaler Matrixumbauvorgänge auslösen, die ihren Höhepunkt in einem "Matrixwechsel" der Sehne finden, der durch die Anhäufung kollagenreicher Typ-III-Nischen dominiert wird. In dieser Dissertation stellen wir die allgemeine Hypothese auf, dass die chronische Entzündung bei Tendinopathie in erster Linie ein von der EZM gesteuertes Phänomen ist, bei dem die Zusammensetzung der EZM und/oder die Gewebesteifigkeit die sehnenansässige Stromazellen in Richtung einer fibro-inflammatorischen Aktivierungsbahn präkonditionieren.
Durch die Kombination von ingenieurwissenschaftlichen Prinzipien und Biomaterialien haben wir drei Mechanokultursysteme entwickelt und eingesetzt, um das Zusammenspiel zwischen der Matrixspannung und der biochemischen Matrixzusammensetzung in Sehnen präzise und kontrolliert zu untersuchen. Zuerst entwickelten wir eine modulare, auf Hebelarmkonstruktion basierende Mechanokulturplattform, die es uns ermöglichte, die statische Matrixspannung von sehnenähnlichen Gewebemimetika einfach zu variieren. Durch die Entkopplung der Matrixsteifigkeit von den Gewebeeigenschaften, also der Vernetzungsdichte der EZM-Liganden, konnten wir mit diesem Mechanokultursystem zeigen, dass in Sehnenfibrose-Modellen eine andauernde mechanische Spannung das Weiterbestehen des pathologischen Umbaus bestimmt. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass eine erhöhte Matrixspannung negativ mit der Transkription der wichtigsten fibrogenen Kollagene korreliert, was von der bekannten Verknüpfung zwischen zweidimensionaler Matrixsteifigkeit und Hochregulierung von Kollagenexpression abweicht.
Anschliessend untersuchten wir die physiologische und klinische Relevanz dieser Befunde in Modellen der systemischen Sklerose (sSk). Wir haben die Sehnen des Fra2/Fosl2(Tg)- Überexpressionsmausmodells, das einen der sSk ähnlichen Entzündungsphänotyp aufweist, biomechanisch charakterisiert. Wir fanden, dass die Sehnen von Fra2(Tg)-Mäusen eine gestörte mechanische Homöostase aufweisen, was sich im Vergleich zu Wildtyp-Kontrolltieren durch eine durchschnittliche Zunahme des Sehnen-Elastizitätsmoduls (E.) von etwa 23% kennzeichnet. Anschliessend untersuchten wir die Transkription der wichtigsten Matrisom-Kollagene in diesen Mäusen sowie in seltenen Sehnenproben aus einer sSk-Autopsie. Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass die Matrixversteifung auch negativ mit der Transkription der wichtigsten pro-fibrotischen Kollagene in den in vivo Modellen der sSk korreliert. Insgesamt konnte mit dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass der fibrogene Umbau in der Sehne mechanisch gesteuert wird, und es zeigte sich, dass durch mechanische Spannung regulierte Rückkopplungsschleifen wahrscheinlich ein zentrales Merkmal der Sehnenfibrose bei der systemischen Sklerose sind.
In der zweiten Studienreihe versuchten wir, die homöostatische Spannung der Zellen auf der Längenskala zu modulieren, indem wir die Steifigkeit der Matrix mit Hilfe zweidimensionaler, planarer Substrate variierten. Wir entwickelten eine regulierbare, mechanisch variable Plattform auf Silikonbasis mit überragender Skalier- und Reproduzierbarkeit. Diese Plattform ermöglichte es uns, in vitro Kulturen menschlicher Sehnenfibroblasten direkt aus frisch isolierten Zellen zu starten, ohne die Zellen jemals auf den ultrasteifen Gewebekulturkunststoff zu bringen. Wir nutzten diese mechanisch variablen Substrate zusammen mit RNA-Sequenzierung und Bioinformatik, um die steifigkeitssensitiven Reaktionen menschlicher Sehnenstromazellen auf der Systemebene zu kartieren. Wir fanden heraus, dass der Bereich der Matrixsteifigkeit, der sich der mikroskaligen Sehnensteifigkeit annähert (z. B. ~35 kPa), eine sehnengewebespezifische Transkriptionssignatur deutlich begünstigt, während bei abweichender Spannungshomöstase die Aktivierung dieser sehnenspezifischen Signalwegen aufgehoben wurde. Insbesondere vermittelte die Sehnenmatrix nachahmenden Steifigkeiten jene Transkriptionsprogramme, die mit dem Chromatinumbau und dem mechanoreaktiven Hippo-Signalweg zusammenhängen. Im Gegensatz dazu waren Prozessen im Zusammenhang mit Pluripotenz, Synapsenbildung und Angiogenese bei niedrigen Steifigkeiten (E. ~2 kPa) angereichert/erhöht. Computergestützte Rückschlüsse auf Regulatoren, die diesen Prozessen vorgelagert sind, ergaben, dass ERK1/2 und AKT1 die wichtigsten Signalvermittler für die Steifigkeitssensitivität bei Sehnenzellen sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir die transkriptionellen mechanischen Reaktionen von Stromazellen aus menschlichen Sehnen in Abhängigkeit von der Matrixsteifigkeit untersucht haben. Diese Ergebnisse beleuchten, wie die mechanische Reaktion auf die Matrixspannung verschiedene, bisher unterschätzte mechanosensitive Prozesse in Sehnenfibroblasten regulieren kann, und definierten den Bereich um E. ~35 kPa als ein Steifigkeitsfenster, das sehnengewebespezifische transkriptomische Signaturen in vitro wiederherstellt.
Im letzten Kapitel untersuchten wir eine der seit langem unbeantworteten Fragen auf dem Gebiet der Sehnen: «Welche Rolle spielt Kollagen Typ III in der Sehnenhomöostase und bei Sehnenerkrankungen?» Wir nutzten die oben erwähnten in vitro Mechanokulturmodelle und entwickelten ein dreidimensionales Hydrogelsystem, mit dem wir die Steifigkeit der perizellulären Matrix (PZM) unabhängig von der Zusammensetzung und Architektur der Kollagenliganden einstellen konnten. Wir konnten zeigen, dass perizelluläres Kollagen Typ III und dysregulierte Matrixspannung synergistisch die pro-inflammatorische Aktivierung und den EZM-remodellierenden Phänotyp in Sehnenstromazellen regulieren. Wir entdeckten, dass Sehnenzellen perizelluläres Kollagen III über den G-Protein-gekoppelten Adhäsionsrezeptor GPR56/ADGRG1 wahrnehmen. Die Agonistenaktivierung des endogenen GPR56 löste eine Transkriptionssignatur aus, die die Kollagen-III-vermittelten Phänotypen in 3D-Hydrogel-Nischen widerspiegelt, mit vielen Merkmalen, die auf einen EZM-Umbau und veränderte Zell-EZM-Interaktionen und damit verbundene Zytoskelett-Antworten hindeuten. Durch Gain-of-Function und CRISPR-Cas9-vermittelte genetische Ablation zeigten diese Studien ausserdem, dass GPR56 die PZM-Zusammensetzung in Sehnenzellen steuert, wahrscheinlich über eine RhoA-Actomyosin-Mechano-Signalachse. Zusammengenommen ergab diese Arbeit, dass eine erhöhte Anhäufung von Typ-III-Kollagen und dessen Bindung an GPR56 das homöostatische Gleichgewicht zwischen Sehnenzellen und PZM verändert, indem verschiedene mechanoreaktive intrazelluläre Signalkaskaden ausgelöst werden. Die Ergebnisse zeigen, dass der Kollagen-III-spezifische Rezeptor GPR56/ADGRG1 eine wichtige Rolle bei der Wahrnehmung und Integration von perizellulären Reizen im Bindegewebe spielen könnte.
Zusammengefasst vertieft diese Dissertation unser grundlegendes Verständnis zur Rolle der Mechanik und Zusammensetzung der EZM bei der Regulierung der Spannungshomöostase von Sehnen in gesundem und krankem Zustand. Noch wichtiger ist, dass diese Arbeit eine bisher unbeschriebene Rolle des GPR56/ADGRG1-Rezeptors als "kontextbezogener Mechanosensor" aufgedeckt hat, was neue Wege zur Erforschung grundlegender mechanosensorischer Mechanismen in Sehnen und anderen Bindegeweben eröffnet.