Collagen, the main component of bone extracellular matrix (ECM) represents a protein with a defined super-molecular organization. For stable fibril formation, the basic element of collagen, the fiber undergoes several intra- and extracellular modifications. One major process of collagen / matrix maturation is collagen cross-link formation. This process is tissue-specific, and involves a variety of cellular and matrix derived signals. Inhibition of lysyl oxidase (Lox), an enzymatic key player in cross-link formation, leads to improper collagen cross-linking and altered fibrillogenesis. In vitro and in vivo experiments confirmed that these aberrations in matrix formation are accompanied by loss of bone mineral, reduced bone strength and altered mineralization.
A further factor involved in tissue development is regulation of gene expressions by epigenetic DNA methylation. To date, sparse research has been performed regarding the significance of this mechanism for bone development and pathogenesis. Therefore, in this thesis the role of epigenetic mechanisms in osteoblastic development was examined.
By treatment of the murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cell line with two lysyl oxidase inhibitors, namely beta aminopropionitrile (bAPN) and homocysteine (hcys), we monitored and compared the effects of these two lathyrogens on the osteoblastic cells. The expression levels of osteoblastic genes were analyzed employing quantitative real time PCR (qPCR) and gene expression microarrays. Markers for osteoblastic activity and cell proliferation were analyzed by viability tests and alkaline phosphatase activity tests and effects on collagen cross-link formation were measured by FTIR. First results indicated that bAPN as well as hcys, besides the enzymatic inhibition down regulate the mRNA expression of Lox. Due to the greater clinical relevance of hcys, using ELISA, immuno blotting and chromatin immuno precipitation techniques we identified the cellular pathway responsible for the effect of hcys on the expression of Lox. This involves IL-6, the transcription factor FLI1 and the DNA methyltransferase DNMT1. DNA methylation analysis of the Lox promoter revealed that hcys suppresses Lox expression by DNA methylation.
Finally, a new mechanism controlling ECM mediated proliferation and differentiation of osteoblasts was elucidated. By seeding MC3T3-E1 cells on collagen type I we observed an up-regulation of osteoblastic genes and a down regulation of the pro-apoptotic gene Fas when compared to control. Using several inhibitors, qPCR and DNA methylation analysis we found that extra-cellular collagen type I via FAK, MAPK and the transcription factor AP1 directly up-regulates Dnmt1 which in turn maintains promoter methylation of the gene Fas thus repressing its expression.
Kollagen Typ I, der Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix des Knochens, weist eine super-molekulare Organisation auf. Die einzelnen Kollagenmoleküle werden einer Reihe von intra- und extrazellulären Modifikationen unterzogen, die es ihnen ermöglicht extrazellulär Kollagenfibrillen auszubilden. Ein wesentlicher Schritt dabei ist die Ausbildung von Kollagenquervernetzungen. Dieser Prozess ist gewebespezifisch und wird von vielen zellulären und matrix-abhängigen Signalen gesteuert. Hemmung der Lysyloxidase (Lox), ein Schlüsselenzym der Kollagenvernetzung, führt zu veränderten Quervernetzungen und gestörter Fibrillogenese. Ergebnisse aus in-vitro als auch in-vivo durchgeführten Experimenten bestätigten, dass solche Veränderungen zu Knochenmineralverlust, reduzierter Knochenfestigkeit und einer veränderten Mineralisation führen.
Ein weiterer Faktor der eine wesentliche Rolle in der Organ und Gewebsentwicklung spielt ist die Regulierung der Expression von Genen durch epigenetische DNA-Methylierung. Bis zum jetzigen Zeitpunkt ist die Bedeutung von diesem Mechanismus in der Knochenentwicklung und Pathogenese nur wenig erforscht worden. In dieser Dissertation wurde daher auf die Rolle epigenetischer Genregulationen im Osteoblasten intensiv eingegangen.
Nach Behandlung der pre-osteoblastären MC3T3-E1 Maus Zelllinie mit den zwei Inhibitoren der Lox, beta aminopropionitrile (bAPN) und Homocysteine (hcys), haben wir den Effekt von diesen zwei Lathyrogenen auf die Zelllinie analysiert und verglichen. Die Expression von osteoblastären Genen wurde mittels „real time polymerase chain reaction“ (qPCR) und „gene expression microarrays“ untersucht. Marker der osteoblastischen Aktivität und Zellproliferation wurden durch Messung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase sowie Viabilitätstest bestimmt. Die Effekte der Substanzen auf die Kollagenquervernetzung wurden durch „Fourier-Transform-Infrarot-Spektrometrie“ (FTIR) gemessen.
Die ersten Ergebnisse zeigten dass sowohl bAPN als auch hcys Lox nicht nur enzymatisch hemmen sondern auch dessen mRNA Expression vermindern. Unter Berücksichtigung der klinischen Bedeutung von hcys, haben wir den zellulären Signalweg für die hcys-abhängige Verminderung der Lox Expression erforscht. Dabei nutzten wir Techniken wie „Enzyme-linked immunosorbent assay“ (ELISA), Immuno Blotting und Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP). Auswertungen ergaben das Interleukin 6 (IL-6), der Transkriptionsfaktor „Friend leukemia integration 1“ (FLI1) und die DNA-Methyltransferse 1 (DNMT1) in der Repression von Lox durch hcys involviert sind. Untersuchungen an der Promotorregion des Lox-Gens ergaben eine DNA-methylierungsabhängige Regulation der Lox Expression durch hcys.
Im letzten Teil der Arbeit wurde ein neuer Signal –Transduktionsweg aufgeklärt, durch den die extrazelluläre Matrix (ECM) die Proliferation und Differenzierung von Osteoblasten fördern kann. Beim Aussähen von MC3T3-E1 Zellen auf mit Kollagen Typ I beschichtete Platten haben wir eine erhöhte Expression an osteoblastären Genen und eine verminderte Expression des pro-apoptotischen Gens Fas beobachtet. Durch die Verwendung verschiedener Inhibitoren, qPCR und DNA-Methylierungsanalysen konnten wir zeigen, dass das extrazelluläre Kollagen Typ I via FAK, MAPK und den Transkriptionsfaktor AP1 direkt die Expression des Gens Dnmt1 stimuliert was in weiterer Folge für die Stilllegung des Gens Fas durch epigenetischer DNA-Methylierung verantwortlich ist.