Engineering Hyaluronan-Tyramine Hydrogels to Modulate Mesenchymal Stem Cell Behavior

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URL: http://hdl.handle.net/20.500.11850/122316

Abstract (English)

Biocompatible hyaluronan (HA) hydrogels are important biomaterials for tissue repair strategies due to their amenable material properties and biocompatibility. Among them, tyramine-modified HA (HA-Tyr) hydrogel is an exciting material for biomedical applications as it is comprised of naturally occurring components. In addition, its ability to be crosslinked enzymatically, with horseradish peroxidase (HRP) and hydrogen peroxide (H2O2), allows for control over gelation and crosslinking density.

This dissertation aimed to optimize and characterize the biophysical properties of tyramine modified hyaluronan (HA-Tyr) hydrogels and investigate their capability to serve as a biomimetic hydrogel platform for stem cell engineering and tissue repair. In addition to advancing understanding of HA-Tyr chemistry and crosslinking strategies, this work investigated how mesenchymal stem cells (MSCs) respond to HA-Tyr microenvironmental cues.

First, 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) was employed as conjugation strategy to synthesize HA-Tyr derivatives. The optimized derivatization process achieved accurate control over the degree of tyramine functionalization. DMTMM facilitated preparation of highly functionalized HA-Tyr derivatives, as shown by a four-fold increase in final yields compared to the traditional carbodiimide mediated HA-Tyr synthesis. The control over the degree of tyramine substitution allowed for precise tailoring of the physico-chemical properties of the crosslinked HA-Tyr hydrogels. Toward spatio-temporal control of the gelation process, photocrosslinking of HA-Tyr hydrogels by tyramine oxidation was introduced. The visible light induced crosslinking was shown as a complementary tool to the previously reported crosslinking with horseradish peroxidase (HRP) and hydrogen peroxide (H2O2). Temporal control of gelation offered dynamic stiffening of HA-Tyr substrates and non-toxic conditions for photo-encapsulation of MSCs.

Next, the applicability of HA-Tyr as a biomimetic microenvironment to study stem cell early attachment and behavior was investigated. The crosslinking strategy (enzymatic versus photocrosslinking) of HA-Tyr hydrogels alters the biophysical cues that MSC sense and respond to. At equal initial substrate stiffness, MSCs cultured on enzymatically crosslinked HA-Tyr substrates possessed larger spreading areas and focal adhesions, whereas smaller MSCs on photocrosslinked hydrogels were more contractile and generated stronger forces to the matrix. These findings indicated that the crosslinking chemistry of covalently formed hyaluronan hydrogels is an important parameter and needs to be considered when looking at MSC adhesion and behavior. Finally, an early osteogenic marker for MSC osteogenesis in vitro was developed, which utilizes the Runx2/Sox9 mRNA expression ratio on day 7 and reliably predicts the osteogenic potential of each particular MSC donor. This study revealed that the downregulation of Sox9 is an important indicator for MSC osteogenesis rather as opposed to indicators which focus solely on Runx2 mRNA expression. Finally, a method to observe Runx2/Sox9 mRNA expression in individual live cells was established, which can be a valuable tool for studying MSC differentiation on HA-Tyr substrates.

Taken together, this dissertation generated a versatile HA-Tyr hydrogel platform that is an attractive matrix for stem cell engineering and for tissue engineering.

Abstract (German)

Hydrogele, die aus biokompatibler Hyaluronsäure (HA) bestehen sind, aufgrund ihrer günstigen Material Eigenschaften und Biokompatibiltät, von grosser Wichtigkeit in Bereich der Regenerativen Medizin. Im Bereich dieser Hydrogels, sind Tyramin-modifizierte HA (HA-Tyr) Hydrogele sehr vielversprechend für biomedizinische Anwendungen, da sie vollständig aus natürlich vorkommenden Komponenten bestehen. Zusätzlich erlaubt die enzymatische Vernetzung mit Meerrettichperoxidase (HRP) und Wasserstoffperoxide (H2O2) exzellente Kontrolle über die Herstellung und die Stärke der Gel-vernetzung.

Das Ziel diese Dissertation war die biophysikalischen Eigenschaften von HA-Tyr Hydrogelen zu optimieren und eine biomimetische Hydrogel Plattform zu etablieren, die es erlaubt grundlegende Experimente mit Stammzellen durchzuführen und Reparaturstrategien von verschiedenen Gewebearten zu untersuchen. Zusätzlich beabsichtigte diese Arbeit die Grundlagen der HA-Tyr Synthese und Hydrogel Präparation zu verstehen um damit die Reaktionen und Verhaltensstrukturen Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) auf HA-Tyr Hydrogelen zu untersuchen.

Im ersten Schritt wurde 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) als Konjugations-Strategie für die Synthese von HA-Tyr Derivaten angewendet. Im Gegensatz zur traditionellen Konjugation mit Carbodiimiden, gelang es mit Hilfe von DMTMM den Modifizierungsgrad von HA-Tyr genauestens zu kontrollieren und zusätzlich um das Vierfache zu erhöhen. Aufgrund der akkuraten Kontrolle über die Funktionalisierung konnten HA-Tyr Hydrogele mit sehr präzise zugeschnittenen physikalisch-chemischen Eigenschaften hergestellt werden. Um auch eine zeitliche und räumliche Kontrolle der Hydrogel Herstellung zu erreichen, wurde die licht-induzierte Vernetzung eingeführt, die aufgrund der Oxidierung von Tyramin zu kovalenten Verbindungen führt. Hier haben wir sichtbares Licht verwendet, das als eine ergänzende Möglichkeit zu der bereits bekannten enzymatischen Methode mit HRP und H2O2 genutzt werden kann. Mit Hilfe dieser zeitlichen Kontrolle über die Hydrogel Herstellung konnten HA-Tyr Hydrogele graduell verfestigt werden und aufgrund nicht-toxischer Eigenschaften, MSCs inkorporiert und kultiviert werden.

Für die Anwendung von HA-Tyr Hydrogelen im Bereich der Regenerativen Medizin ist es wichtig das Verhalten von Stammzellen auf diesen Biomaterialien zu verstehen. Hier wurde gezeigt, dass die Art der Hydrogel Herstellung (enzymatisch versus licht-induziert) die biophysikalischen Eigenschaften von HA-Tyr so verändert, dass MSCs dies fühlen können und sich dementsprechend anders verhalten. Obwohl die initialen mechanischen Eigenschaften gleich waren, zeigten MSCs auf enzymatischen hergestellten Gelen ein generell grösseres Wachstumsareal und grössere Fokale Adhäsion Punkte, während die kleineren Zellen auf Lichtvernetzten Gelen kontraktiler waren und grössere Kräfte auf die Hydrogelmatrix ausübten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Vernetzungsstrategie von HA-Tyr Hydrogelen ein wichtiger Parameter ist und beachtet werden sollte, wenn das Verhalten von Stammzellen beurteil wird.

Zum Schluss wurde ein frühzeitiger Marker für die osteogene Differenzierung von MSCs entwickelt, welcher auf dem Verhältnis der Runx2 und Sox9 Genexpression am Tag 7 basiert und sehr verlässlich das osteogene Potenzial von einzelnen MSC Spendern vorhersagen kann. Diese Studie zeigte, dass die Herunterregulierung von Sox9 ein wichtiger Indikator der osteogenen Differenzierung von MSCs ist, und verlässlicher ist als nur die Runx2 Genexpression zu messen. Zusätzlich wurde eine Methode gezeigt, mit der man dieses Runx2/Sox9 Verhältnis in lebenden Zellen messen kann. Dies ist sehr hilfreich für die Untersuchung der MSC Differenzierung auf HATyr Hydrogelen.

Zusammenfassend hat diese Dissertation eine vielseitige HA-Tyr Hydrogel Plattform entwickelt, die sehr attraktiv ist für die Erforschung von Stammzellverhalten, mit dem ultimativen Ziel Gewebe zu regenerieren.

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