Cell-based bone tissue engineering emerged as a promising strategy for bone tissue regeneration to overcome the limitations of bone grafting and bone graft alternatives. From the currently available clinical data of cell-based bone tissue engineering, it has become clear that more reproducible osteogenic cell populations for improved bone formation, as well as cell populations with endothelial potential to account for sufficient vascularization, harbor the potential to improve bone tissue engineering. However, adult stem and progenitor cell isolation is hampered by the lack of specific and robust cell surface markers required to reliably perform cell characterization and isolation. Since the resulting heterogeneity of adult stem and progenitor cell populations represents a major obstacle for the progress of adult stem cell biology and applied disciplines, such as bone tissue engineering, the present work was aimed at establishing a novel approach for the identification and isolation of osteoprogenitor and endothelial progenitor cell (EPC) populations from human bone marrow stromal cells (BMSC) and mononuclear cells, respectively. Functional isolation was approached by coupling the expression of a key transcription factor, defining the subpopulation of interest, to the expression of green fluorescent protein (GFP) reporter gene. This reporter system was used to discriminate and isolate cell populations based on fluorescence by means of fluorescence activated cell sorting (FACS).

Several non-viral and viral reporter constructs were generated, each of which was responsive to a particular transcription factor relevant for osteogenesis or endothelial biology.

As regards osteoprogenitors, the well-documented master transcriptional regulator of osteoblast differentiation, RUNX2, accounted for the specificity of the adenoviral reporter Ad.Runx2. Osteogenically induced human BMSCs transduced with Ad.Runx2 were subdivided and the reporter-positive cell population exhibited characteristics appropriate for osteoprogenitors. The pattern of in vitro osteogenic differentiation capability amongst the resulting cell populations in comparison with the original BMSC population indicated a crosstalk between cell populations. Inconsistent results initiated a re-evaluation phase that indicated the original hypothesis, claiming that a single reporter responsive to an appropriate transcription factor is sufficient to reproducibly isolate the progenitor cell population of interest, was incorrect. Thus a new hypothesis, namely that dual reporter systems are required, was proposed.

Extension of the adenoviral GFP reporter system to a lentiviral luciferase reporter system circumvents transient reporter expression and low signal sensitivity. Combined with a standardized cell population, these new cell lines are aimed at additionally utilizing the reporter system for biomaterials testing or drug screening. We performed a candidate drug testing approach to investigate the natural compound resveratrol that had been reported to upregulate Runx2 gene expression for its ability to induce a detectable increase in reporter expression in the self-generated lentivirally transduced stable Runx2 reporter hTERT-MSC system. Stable Runx2 reporter hTERT-MSCs were generated by transduction of human MSCs immortalized through expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) (hTERT-MSC) with lentiviral Runx2-specific luciferase reporter constructs. The experiment revealed insignificant differences in reporter expression upon resveratrol treatment, indicating that the stable Runx2 reporter hTERT-MSC system is insufficiently sensitive in the performed drug testing approach.

To produce the EPC-specific adenoviral reporters, the transcription factors HOXA9 and VEZF1 were investigated, based on published data present at that time. In vitro validation of these adenoviral reporters revealed that neither of the transcription factors are EPC- /endothelial-specific, which prompted us to not perform EPC isolation experiments. Collectively, we have established the first step in a novel and versatile approach to functionally identify and isolate progenitor cell populations. Our novel approach fills a niche in the spectrum of possibilities to isolate more homogeneous stem and progenitor populations. Transcription factor-specific reporters not only serve as basis to functionally subdivide and isolate committed subpopulations of stem cell populations, but also as tool for applied approaches such as drug screening and biomaterials testing.

Our results contributed two major pieces of insight to the usage of transcription factor- specific reporters. First, transcription factors need to be considered as players within a regulatory network, which renders single transcription factor-specific reporters prone to inconsistency and lack of robustness. Instead, multiple reporters may serve as more reliable and satisfying indicators of cell lineage specification processes. Second, transcription factor-specific reporters are not necessarily dependent on a transcription factor that is cell type- and tissue-specifically expressed, but need to meet the criterion for specificity only in the range of cell fates the starting cell population can give rise to. These findings have implications both reaching basic research applications and touching clinical applications in the field of stem and progenitor cell biology.

Zellbasiertes Knochen-Tissue-Engineering entwickelte sich als eine erfolgversprechende Strategie für die Knochenregeneration, um die Einschränkungen von Knochentransplantationen und Knochenersatzmaterialien zu bewältigen. Die derzeit verfügbaren klinischen Daten zu zellbasiertem Knochen-Tissue-Engineering haben deutlich gemacht, dass reproduzierbarere osteogene Zellpopulationen als auch Zellpopulationen mit endothelialem Potential, die für bessere Knochenbildung beziehungsweise für ausreichende Vaskularisierung sorgen, das Potential haben, das Knochen-Tissue-Engineering zu verbessern. Die Isolation von adulten Stamm- und Vorläuferzellen wird jedoch durch das Fehlen von spezifischen und robusten Zelloberflächenmerkmalen erschwert, welche für eine zuverlässige Zellcharakterisierung und -isolation nötig sind. Da die resultierende Heterogenität der adulten Stamm- und Vorläuferzell-Populationen ein wesentliches Hindernis für Fortschritte in der adulten Stammzellbiologie und den anwendungsorientierten Disziplinen wie dem Knochen-Tissue- Engineering darstellt, hatte diese Arbeit das Ziel, einen neuen Ansatz für die Identifizierung und Isolation von Knochenvorläuferzell-Populationen und endothelialen Vorläuferzell- Populationen aus humanen Knochenmark-Stromazellen beziehungsweise mononukleären Zellen zu entwickeln. Die funktionelle Isolation erfolgte durch Kopplung der Expression eines Haupttranskriptionsfaktors, der die betreffende Subpopulation definiert, mit der Expression des Reportergens für grün fluoreszierendes Protein (GFP). Mit Hilfe dieses Reportersystems wurden Zellpopulationen auf der Grundlage von Fluoreszenz mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) unterschieden und isoliert.

Mehrere nicht-virale und virale Reporterkonstrukte wurden hergestellt, von denen jedes einzelne auf einen bestimmten für die Knochen- oder Blutgefässbildung relevanten Transkriptionsfaktor anspricht.

Bezüglich der Knochenvorläuferzellen wurde die Spezifität des adenoviralen Reporters Ad.Runx2 durch den gut dokumentierten transkriptionellen Hauptregulierer der Osteoblastendifferenzierung, RUNX2, gewährleistet. Bei der Unterteilung von osteogen induzierten menschlichen Knochenmark-Stromazellen, welche mit Ad.Runx2 transduziert wurden, zeigte sich, dass die Reporter-positive Zellpopulation Eigenschaften von Knochenvorläuferzellen aufwies. Dabei deutete das Muster der osteogenen In-vitro- Differenzierungsfähigkeit bei den resultierenden Zellpopulationen im Vergleich mit der Differenzierungsfähigkeit der ursprünglichen humanen Knochenmark-Stromazell- Population auf ein Zusammenwirken der Zellpopulationen hin. Aufgrund inkonsistenter Ergebnisse erfolgte eine Neubewertung, welche zeigte, dass die ursprüngliche Hypothese wonach ein einzelner Reporter, der auf einen geeigneten Transkriptionsfaktor anspricht, ausreicht, um die untersuchte Vorläuferzell-Population reproduzierbar zu isolieren, inkorrekt war. Es wurde daher die neue Hypothese, gemäss welcher ein doppelter Reporter dazu notwendig ist, aufgestellt.

Die Ausdehnung des adenoviralen GFP-Reportersystems auf ein lentivirales Luciferase- Reportersystem umgeht die transiente Expression des Reporters und die geringe Signalempfindlichkeit. Nach Kombination des lentiviralen Luciferase-Reportersystems mit einer standardisierten Zellpopulation ist es das Ziel, die resultierenden neuen Zelllinien für die Prüfung von Biomaterialien oder für das Arzneimittel-Screening zu verwenden. Wir untersuchten den Naturstoff Resveratrol, der Berichten zufolge die Genexpression von Runx2 erhöht, auf seine Fähigkeit, eine nachweisbare Erhöhung der Reporterexpression in den selbsterzeugten stabilen lentiviral transduzierten Runx2-Reporter-hTERT-MSC-Linien herbeizuführen. Stabile Runx2-Reporter-hTERT-MSCs wurden durch Transduktion von humanen Telomerase-immortalisierten mesenchymalen Stammzellen (hTERT-MSC) mittels lentiviralen Runx2-spezifischen Luciferase-Reporterkonstrukten erzeugt. Bei Behandlung mit Resveratrol zeigten sich geringfügige Unterschiede in der Reporterexpression, was auf eine unzureichende Empfindlichkeit des stabilen Runx2- Reporter-hTERT-MSC-Systems hindeutete.

Für die Erzeugung von für endotheliale Vorläuferzellen spezifischen adenoviralen Reportern wurden die Transkriptionsfaktoren HOXA9 und VEZF1, auf der Basis publizierter Daten, untersucht. Die In-vitro-Validierung der beiden adenoviralen Reporter ergab, dass keiner der Transkriptionsfaktoren spezifisch für endotheliale Vorläuferzellen bzw. Endothelzellen ist. Dies veranlasste uns, die Experimente zur Isolation von endothelialen Vorläuferzellen nicht durchzuführen.

Insgesamt betrachtet haben wir den ersten Schritt eines neuen Ansatzes für die funktionelle Identifizierung und Isolation von Vorläuferzell-Populationen entwickelt. Unser neuer Ansatz füllt eine Nische innerhalb des Spektrums an Möglichkeiten zur Isolation von homogeneren Stamm- und Vorläuferzell-Populationen. Dabei stellen Transkriptionsfaktor- spezifische Reporter nicht nur die Grundlage für die funktionelle Unterteilung und Isolation von determinierten Subpopulationen von Stammzellen dar, sondern dienen auch als Hilfsmittel für anwendungsorientierte Ansätze wie zum Beispiel das Arzneimittel- Screening oder die Prüfung von Biomaterialien.