Articular cartilage tissue lacks the ability of self-repair due to its avascular structure and limited access to the body’s healing mechanisms. Current treatment strategies based on the use of autologous chondrocytes demand in vitro expansion in order to achieve sufficient cell yield for implantation into the defect site. Upon monolayer passaging, chondrocytes go under dedifferentiation, a phenomenon marked by an induction of fibroblastic phenotype and loss of chondrogenic markers, that leads to fibrocartilage formation and impaired clinical outcome. This thesis aims to elucidate the characteristics of the cartilage microenvironment and cellular signaling mechanisms that govern native chondrocyte phenotype and to develop biomimetic systems to be used in cartilage tissue engineering.

Cartilage extracellular matrix (ECM) is uniquely enriched in sulfated glycosaminoglycans (GAGs) which have both a physical role such as conferring compressive strength to the tissue via entrapment of water and a biological role through mediating ligand-receptor interactions that initiate downstream signaling pathways. In the first part of the thesis, we developed a biomimetic model based on an inert biopolymer, alginate, to explore the role of sulfate moieties in the chondrocyte microenvironment. We showed that sulfation of alginate drives potent proliferation of encapsulated chondrocytes in a three-dimensional (3D) context in a dose-response manner to the degree of sulfation. Mitogenicity of chondrocytes in the sulfated hydrogels was found to be mediated by activation of fibroblast growth factor (FGF) signaling and independent of biophysical phenomena. Growth of freshly-isolated chondrocytes in alginate sulfate hydrogels led to extensive deposition of cartilage matrix components type II collagen and aggrecan whereas dedifferentiation and catabolic markers were suppressed. We further demonstrated that alginate sulfate acted as an active signaling matrix and facilitated a complex formation between FGF2 and its receptor in a sulfated GAG-mimetic manner to initiate signaling events that regulate cell proliferation and suppression of dedifferentiation.

Cartilage damage due to acute trauma or degenerative diseases is frequently accompanied by an induction of inflammation that leads to further deterioration of the tissue. Engineered scaffolds for cartilage repair are thus challenged by inflammatory cytokines in the defect site upon implantation which could promote matrix loss and impairment of regeneration. In the second part of the thesis, we investigated the role of sulfation in the chondrocyte microenvironment on the inflammatory signaling pathways. Chondrocytes were encapsulated in alginate sulfate and alginate hydrogels to explore interleukin (IL)-1β-stimulated effects on inflammation. Expression of pro-inflammatory genes IL-6, IL-8, cyclooxygenase-2 (COX-2) and catabolic genes such as a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motifs 5 (ADAMTS5) were significantly inhibited in chondrocytes encapsulated in sulfated hydrogels. Protein expression of COX-2 and nuclear factor kappa B (NF-κB) as well as activation of NF-κB and p38 mitogen-activated protein kinases (p38 MAPK) were suppressed in sulfated hydrogels. Furthermore, alginate sulfate hydrogels were observed to exert a significantly higher affinity to IL-1β. Biomimetic alginate sulfate hydrogels, therefore, demonstrated an inhibition of inflammatory induction via sequestration of cytokines and provided a protective microenvironment for the encapsulated chondrocytes.

We then developed an injectable and adhesive version of alginate sulfate hydrogels to address in vivo stability and tissue integration for use in cartilage repair. We demonstrated double modification of alginate with sulfate and tyramine moieties and in situ enzymatic crosslinking with tyrosinase under physiological conditions. Alginate sulfate tyramine (ASTA) and alginate tyramine (AlgTA) hydrogels supported the viability of encapsulated chondrocytes and chondrogenic re-differentiation with an upregulation of collagen type II and aggrecan. ASTA and AlgTA showed strong adhesion to native cartilage while tyrosinase-mediated in situ crosslinking. Finally, the hydrogels were stable in vivo and remained fully intact upon subcutaneous implantation into mice for 4 weeks. We next investigated signaling events that regulate chondrocyte phenotype with an emphasis on the effect of cellular microenvironment such as 3D culturing and oxygen tension. We explored the role of Rho and Wnt signaling and their context-dependent cross-talk in chondrocyte dedifferentiation. Monolayer expansion of chondrocytes caused an upregulation and nuclear translocation of RhoA with concomitant loss of chondrogenic markers. An activation of canonical Wnt signaling in a Rho-dependent manner was observed in dedifferentiated chondrocytes. Inhibiting RhoA activation suppressed its nuclearization, induced re-expression of chondrogenic markers in chondrocytes both on 2D and in 3D hydrogels and led to inhibition of canonical Wnt signaling. Moreover, induction of canonical Wnt signaling in chondrocytes revealed contradictory effects on the expression of chondrogenic markers depending on cellular microenvironment and the activation state of RhoA.

In the last part, we explored the role of hypoxic cartilage microenvironment in the regulation of Rho and canonical Wnt signaling in chondrocytes. We found that hypoxia exerted context-dependent effects on the expression of RhoA and β-catenin. Within 3D hydrogels, hypoxia caused an inhibition of RhoA and β-catenin expression with concomitant redifferentiation and expression of chondrogenic markers. Conversely, hypoxia induced a potent upregulation of RhoA and β-catenin when chondrocytes were cultured on 2D accompanied with a failure in re-expression of chondrogenic phenotype. Hypoxia-induced inhibition of Rho and canonical Wnt signaling in 3D was crucial for the promotion of chondrocyte redifferentiation since activation of Rho or Wnt signaling caused an abrogation of hypoxic re-expression of chondrogenic markers. The effects of hypoxia on Rho and canonical Wnt signaling in chondrocytes were mediated via hypoxia inducible factors (HIF) and could be mimicked by stabilization of HIFs under normoxic conditions. Therefore, these results pointed out oxygen tension as an important factor in regulation of chondrocyte phenotype in synergy with 3D cellular microenvironment.

In conclusion, this thesis demonstrates the importance of biomimicking the native characteristics of the cartilage microenvironment such as ECM components, low oxygen tension and signaling mechanisms involved in cell morphology and mechanotransduction. The biomimetic strategies explained here lead to a better understanding of chondrocyte signaling in different cellular contexts as well as development of scaffolds for use in cartilage tissue engineering.

Grazie alla sua natura avascolare e al limitato accesso ai meccanismi di riparazione, la cartilagine articolare non possiede la capacità di rigenerarsi. Oggigiorno i trattamenti per lesioni cartilaginee si basano sull’uso di condrociti autologhi che richiedono un’espansione in vitro al fine di ottenere un numero sufficiente di cellule da trapiantare. Durante la cultura bidimensionale i condrociti si de-differenziano:​ questo fenomeno è caratterizzato dallo svilupparsi di un fenotipo fibroblastico e da una riduzione di marker condrogenici e porta a un’imparziale riuscita delle operazioni chirurgiche. Lo scopo di questa tesi è di elucidare le caratteristiche del microambiente cartilagineo e i meccanismi di segnalazione cellulare che governano il fenotipo dei condrociti nativi. Inoltre di applicare queste conoscenze per sviluppare strategie bio-mimetiche utili all’ingegneria tissutale della cartilagine.

La matrice extracellulare (ECM) cartilaginea è ricca in glicosamminoglicani solfati (sGAG), che hanno il ruolo sia di fornire resistenza alla compressione meccanica attraverso la ritenzione idrica, sia di mediare le interazioni legando-recettore che iniziano la cascata di segnalazione cellulare. Nella prima parte della tesi, è stato sviluppato un modello bio-mimetico basato su un bio-polimero inerte, l’alginato, per esplorare il ruolo delle molecole solfate nel microambiente dei condrociti. Si è dimostrato che la solfatazione dell’alginato porta ad una potente proliferazione dei condrociti coltivati in 3D e che questa è proporzionale al grado di solfatazione. La crescita dei condrociti in idrogeli solfati avviene mediante l’attivazione della segnalazione cellulare del fattore di crescita fibroblastico (FGF) ed è indipendente da fenomeni biofisici. La proliferazione di condrociti nativi in idrogeli di alginato solfato porta a un’abbondante deposizione dei componenti della matrice cartilaginea come collagene 2 e aggrecani, mentre sopprime l’espressione dei marker catabolici. È stato inoltre dimostrato che l’alginato solfato agisce attivamente nella segnalazione cellulare e facilita la formazione di un complesso tra il FGF2 e il suo recettore in maniera simile ai glicosamminoglicani solfati;​ questo inizia la cascata di eventi che regola la proliferazione cellulare e la soppressione della dedifferenziazione.

Le lesioni alla cartilagine, dovute a traumi e malattie degenerative, sono spesso accompagnate da un’infiammazione che porta ad una ulteriore degenerazione del tessuto. Una volta trapiantati nella lesione, gli scaffold ideati per la riparazione della cartilagine sono quindi sottoposti alla presenza di citochine infiammatorie che promuovono una perdita della matrice extracellulare e ne impediscono la rigenerazione. Nella seconda parte della tesi si è investigato il ruolo della solfatazione in relazione al microambiente cartilagineo e alla segnalazione cellulare in ambiente infiammatorio. Condrociti incapsulati in alginato solfato e alginato sono stati usati per elucidare gli effetti dell’interleuchina (IL)-1β sull’infiammazione. L’espressione di geni pro-infiammatori, IL-6, IL-8, cicloossigenase-2 (COX-2), e di geni catabolici come disintegrina e ADAMTS5 è significativamente inibita nei condrociti in idrogeli solfati. Allo stesso modo, l’espressione proteica di COX-2 e NF-κB, così come l’attivazione di NF-κB e di p38 MAPK, è soppressa in idrogeli solfati. Inoltre si è osservato che l’alginato solfato ha una significativa affinità con IL-1β. Per questo gli idrogeli bio-mimetici di alginato solfato inibiscono infiammazione, sequestrando citochine e fornendo un microambiente protettivo nei confronti dei condrociti.

È stata quindi sviluppata una versione iniettabile e adesiva dell’alginato solfato per far fronte ai problemi di stabilità in vivo e d’integrazione con il tessuto nativo per un uso clinico nella riparazione della cartilagine. È stata dimostrata la possibilità di modificare l’alginato sia con molecole solfate sia tiramina e di gelificarlo enzimaticamente in situ in condizioni fisiologiche grazie all’enzima tirosinase. L’alginato solfato tiramina (ASTA) e l’alginato tiramina (AlgTA) supportano la sopravvivenza di condrociti coltivati in 3D e la re-differenziazione condrogenica attraverso una up-regolazione del collagene 2 e degli aggracani. ASTA e AlgTA possiedono una forte proprietà di adesione al tessuto cartilagineo quando sono gelificati in situ con la tirosinase. Infine, entrambi gli idrogeli sono stabili in vivo e rimangono perfettamente intatti dopo essere trapiantati nei topi per 4 settimane.

In seguito si è investigata la segnalazione molecolare che regola il fenotipo dei condrociti, soprattutto in relazione al microambiente cellulare e a fattori come la cultura tridimensionale e la tensione dell’ossigeno. Sono stati studiati i ruoli di Rho e Wnt, così come la loro implicazione nella di-differenziazione dei condrociti. La coltura bidimensionale dei condrociti porta alla up-regolazione e alla traslocazione di RhoA con conseguente perdita dei marker condrogenici. È stata osservata l’attivazione della segnalazione canonica di Wnt in maniera dipendente da RhoA. L’inibizione di RhoA sopprime la sua nuclearizzazione e induce la re-espressione di marker condrogenici in colture sia bidimensionali che tridimensionali e porta all’inibizione della segnalazione canonica di Wnt. Inoltre, l’induzione della segnalazione canonica di Wnt risulta avere effetti diversi sull’espessione di marker condrogenici a seconda del microambiente cellulare e sullo stato di attivazione di RhoA.

Nell’ultima parte è stato investigato il ruolo dell’ipossia nella regolazione di Rho e della segnalazione canonica di Wnt. È stato dimostrato che l’ipossia ha effetti diversi sull’espressione di Rho e di β-catenin a seconda del contesto cellulare. In colture tridimensionali infatti, l’ipossia provoca l’inibizione di RhoA e β-catenin con conseguente re-differenziazione ed espressione di marker condrogenici. Diversamente, in colture bidimensionali, l’ipossia provoca una forte up-regolazione di RhoA e β-catenin senza re-espressione del fenotipo condrogenico. In colture tridimensionali, l’inibizione di RhoA e la segnalazione canonica di Wnt dovute all’ipossia sono cruciali per promuovere la re-differenziazione dei condrociti. Infatti, l’attivazione di Rho o della segnalazione di Wnt porta all’abrogazione della re-espressione dei marker condrogenici anche in ipossia. Gli effetti dell’ipossia su Rho e sulla segnalazione canonica di Wnt sono stati regolati in vitro grazie a HIF e sono stati simulati stabilizzando HIF in condizioni di normossia. I risultati di questa ricerca suggeriscono che la tensione dell’ossigeno sia un fattore importante nella regolazione del fenotipo dei condrociti assieme al microambiente cellulare tridimensionale.

In conclusione, questa tesi dimostra l’importanza in ingegneria tissutale della cartilagine di imitare le caratteristiche del microambiente cartilagineo:​ i componenti della matrice extracellulare, la bassa tensione dell’ossigeno e la segnalazione cellulare coinvolta nella morfologia cellulare e nella meccano-traduzione. Le strategie biomimetiche qui illustrate portano a una maggiore comprensione della segnalazione cellulare dei condrociti in diversi contesti cellulari, così come contribuiscono a un migliore sviluppo di scaffold per l’ingegneria tissutale della cartilagine