During important processes including developmental morphogenesis, tissue homeostasis and cancer metastasis, adherent cells are both exposed to mechanical forces from their extracellular environment and generate their own internal forces, which are critical regulators in behaviors such as migration, signaling, proliferation and differentiation. As their importance in relation with key biochemical and physical processes was recognized, several methods to measure these cell-generated traction forces were developed in the past 20 years, and are commonly called Traction Force Microscopy (TFM).

Besides their differences in application and detailed implementation, these methods all rely on an indirect approach where not the forces directly, but the deformation caused by those cellular forces on their immediate environment are measured. With known mechanical properties of the underlying substrate, these deformation can then be transformed into a set of reconstructed traction forces.

However, as working with TFM requires a multidisciplinary approach with expertise in cell biology, biophysics, computer vision and material science, these methods are technically difficult to adapt. Therefore, the result is often limited in accuracy and resolution, which is a major drawback since cells apply forces on micron-sized discrete attachment points. Furthermore, due to physical and computational limitations, the three steps involved in TFM, namely imaging, displacement measurement and traction reconstruction, are closely linked to each other and are highly limited to experimental noise and the large parameter space involved in the computational routines. This leads to a sequential error propagation and as a result, the accuracy of the outcome are difficult to assess. Moreover, due to the diverging outcomes of existing TFM methods, the absolute values of various given TFM experiments are difficult to interpret and to put into the right biological perspective, since a uniform and reliable calibration framework is not available.

The first goal of this thesis was to close this gap and to develop a numerical TFM framework that can be used to benchmark existing and develop new and improved methods for cell traction calculation. As opposed to other TFM validation studies, this platform is capable to simulate any given experimental condition in 2D, 2.5D and 3D TFM by the use of a physical model of the microscopic image acquisition, coupled with a finite-element method based numerical model of the force-displacement relationship. As such, the whole TFM process form image acquisition to force reconstruction can be numerically evaluated, both separately and sequentially.

By using a wide range of input parameters, we have shown that the outcome of classical TFM approaches is highly limited by relative accuracy and spatial resolution by which the displacement field is measured, which itself is influenced by the quality and spatial density of the markers by which the deformation is made visible. As a result, this study showed that in order to obtain a useful TFM output, all steps must be optimized equally.

The insights of these validation studies then led to the development of a novel approach for high-resolution TFM, which, based on optical-flow feature tracking, improved traction accuracy of up to 50%, especially for very small focal adhesions. Furthermore, the efficient implementation enabled a considerable fast computation time which allowed the application for high-throughput and paves the way for real-time analysis methods.

In the next step, the outcome of these optimization were applied to two different fields in cellular biomechanics. In the first, we have shown that high metastatic osteosarcoma cells have a reduced contractility compared to their parental cell lines, but show an increased passive cytoskeletal tension when probed in tension. We therefore concluded that the mechanical properties and behavior of cells strongly depends on the method with which they are tested.

In the second study, we have used various hydrophobic and hydrophilic silicone substrates of different stiffness to show that the surface energy-driven ligand assembly may alter stem cell mechanosensitivity. As a result, stem cells could spread and osteogenically differentiate on hydrophobic, but not hydrophilic substrates. In contrast, the cell contractility measured by TFM and activity of Rho Kinases (ROCK) were diminished on soft substrates of both types, in comparison with their stiffer counterpart.

The last part of the thesis showed preliminary steps towards 3D TFM, where both the simulation and evaluation environment were expanded into the third dimension. Although computationally much more demanding, we could show that an ideal combination of high marker density and specialized tracking approach can lead to highly improved results.

In conclusion, a novel numerical framework for the evaluation and calculation of high-resolution traction forces has contributed to the field of TFM on many levels. In particular, we have presented:​ (i) A calibration framework for TFM error quantification, (ii) Based on this results improved TFM methods and (iii) Application of the results to state-of-the art biomechanical research. We believe that this work contributes to the wide adaption of TFM to answer major biological and medical questions in diagnosis and therapy.

Während wichtiger Prozesse wie der Morphogenese der Entwicklung, der Homöostase des Gewebes und der Metastasierung von Krebserkrankungen sind adhärente Zellen mechanischen Kräften aus ihrer extrazellulären Umgebung ausgesetzt und erzeugen ihre eigenen inneren Kräfte, die wichtige Regulatoren für Verhaltensweisen wie Migration, Signalisierung, Proliferation und Differenzierung sind. Da ihre Bedeutung in Bezug auf wichtige biochemische und physikalische Prozesse erkannt wurde, sind in den letzten 20 Jahren mehrere Methoden zur Messung dieser zellgenerierten Zugkräfte entwickelt worden, die allgemein als Traction Force Microscopy (TFM) bezeichnet werden. Abgesehen von ihren Unterschieden in der Anwendung und der detaillierten Implementierung beruhen diese Methoden alle auf einem indirekten Ansatz, bei dem nicht die Kräfte direkt gemessen werden, sondern die Verformung, die durch diese zellulären Kräfte auf ihre unmittelbare Umgebung verursacht wird. Bei bekannten mechanischen Eigenschaften des darunter liegenden Substrats können diese Deformationen dann in einen Satz rekonstruierter Zugkräfte umgewandelt werden.

Da die Arbeit mit TFM jedoch einen multidisziplinären Ansatz mit Fachkenntnissen in Zellbiologie, Biophysik, Bildanalyse und Materialwissenschaft erfordert, sind diese Methoden technisch schwer adaptierbar. Daher ist das Ergebnis oft in Genauigkeit und Auflösung begrenzt, was ein großer Nachteil ist, da Zellen die Kräfte auf diskrete Fokale Adhäsionen im Mikrometerbereich ausüben. Darüber hinaus sind die drei Schritte, die in TFM involviert sind, nämlich Bildgebung, Wegmessung und Kraftrekonstruktion, aufgrund physikalischer und rechnerischer Einschränkungen eng miteinander verknüpft und stark Begrenzt durch experimentelles Rauschen sowie den großen Parameterraum, der in die Berechnungsroutinen involviert ist. Dies führt zu einer sequentiellen Fehlerfortpflanzung, so dass die Genauigkeit des Ergebnisses schwer einzuschätzen ist. Darüber hinaus sind die Absolutwerte verschiedener TFM-Experimente aufgrund der unterschiedlichen Ergebnisse bestehender TFM-Methoden schwer zu interpretieren und in die richtige biologische Perspektive zu bringen, da ein einheitlicher und zuverlässiger Kalibrierrahmen nicht zur Verfügung steht.

Das erste Ziel dieser Doktorarbeit war es, diese Lücke zu schließen und ein numerisches TFM-Framework zu entwickeln, mit dem man bestehende Methoden zur Berechnung der Zellkräfte vergleichen sowie neue und verbesserte Methoden entwickeln kann. Im Gegensatz zu anderen TFM-Validierungsstudien ist diese Plattform in der Lage, jede beliebige experimentelle Bedingung in 2D, 2.5D und 3D TFM durch die Verwendung eines physikalischen Modells der mikroskopischen Bildaufnahme, gekoppelt mit einem auf der Finite-Elemente-Methode basierenden numerischen Modell der Kraft-Weg-Beziehung, zu simulieren. So kann der gesamte TFMProzess von der Bildaufnahme bis zur Kraftrekonstruktion sowohl separat als auch sequentiell numerisch ausgewertet werden.

Durch die Verwendung eines breiten Spektrums von Parametern haben wir gezeigt, dass das Ergebnis klassischer TFM-Ansätze durch die relative Genauigkeit und räumliche Auflösung, mit der das Verschiebungsfeld gemessen wird, stark eingeschränkt ist, was wiederum durch die Qualität und räumliche Dichte der Marker beeinflusst wird, durch die die Verformung sichtbar gemacht wird. Als Ergebnis dieser Studie zeigte sich, dass alle Schritte gleichermaßen optimiert werden müssen, um einen brauchbaren TFMErgebnis zu erhalten.

Die Erkenntnisse aus dieser Validierungsstudie führten dann zur Entwicklung eines neuartigen Ansatzes für hochauflösendes TFM, der auf der Basis von Optical-Flow-Feature-Tracking eine verbesserte Kraftrekonstruktionsgenauigkeit von bis zu 50 %, insbesondere bei sehr kleinen Fokalen Adhäsionen, ermöglicht. Darüber hinaus erlaubte die effiziente Implementierung eine beachtlich schnelle Rechenzeit, die den Einsatz im Hochdurchsatz ermöglichte und den Weg für Echtzeit-Analysemethoden ebnete.

Im nächsten Schritt wurden die Ergebnisse dieser Optimierung auf zwei verschiedene Bereiche der zellulären Biomechanik übertragen. Im ersten Fall haben wir gezeigt, dass hochmetastatische Osteosarkomzellen eine geringere Kontraktilität im Vergleich zu ihren elterlichen Zelllinien aufweisen, aber eine erhöhte passive Spannung des Cytoskeletts zeigen, wenn sie auf Zug untersucht werden. Wir kamen daher zu dem Schluss, dass das mechanische Verhalten von Zellen stark von der Methode abhängt, mit der sie getestet werden.

In der zweiten Studie haben wir verschiedene hydrophobe und hydrophile Silikonsubstrate mit unterschiedlicher Steifigkeit verwendet, um zu zeigen, dass die oberflächenenergiegetriebene Ligandenanordnung die Mechanosensitivität der Stammzellen verändern kann. Dadurch konnten sich Stammzellen auf hydrophoben, aber nicht hydrophilen Substraten ausbreiten und osteogen differenzieren. Im Gegensatz dazu ist die Zellkontraktilität, welche mit TFM und durch der Aktivität der Rho Kinasen (ROCK) gemessen wurde, auf weichen Substraten beider Typen im Vergleich zu ihrem steiferen Gegenstück vermindert.

Der letzte Teil der Doktorarbeit zeigte erste Schritte in Richtung 3D TFM, wo sowohl die Simulations- als auch die Auswertungsumgebung in die dritte Dimension erweitert wurden. Obwohl rechnerisch wesentlich anspruchsvoller, konnten wir zeigen, dass eine ideale Kombination aus hoher Markerdichte und spezialisiertem Tracking-Ansatz zu stark verbesserten Ergebnissen führen kann.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein neuartiger numerischer Rahmen für die Bewertung und Berechnung von hochauflösenden Zugkräften auf vielen Ebenen zum Gebiet der TFM beigetragen hat. Insbesondere haben wir vorgestellt:​ (i) Eine Kalibrierungsumgebung für die TFM-Fehlerquantifizierung, (ii) Basierend auf diesen Ergebnissen verbesserte TFM-Methoden und (iii) Anwendung der Ergebnisse auf modernste biomechanische Forschung. Wir sind davon überzeugt, dass diese Arbeit dazu beiträgt, dass TFM bald in der Lage sein wird, wichtige biologische und medizinische Fragen in Diagnostik und Therapie zu beantworten.