Tendons are connective tissues that transmit forces from muscles to bones, and thereby experience large mechanical loads. Body movements and athletic performances rely on tendons as they store and return elastic energy in a catapult-like manner. For decades scientists have described exerciseinduced tendon adaptations and the benefits of treating tendon diseases with controlled mechanical stimulation. However, the challenging question of how tendon mechanical properties are regulated at the cellular and molecular level according to cell-perceived forces remains elusive.
To address this question, we developed a novel imaging system to simultaneously stretch and image Ca²⁺ dynamics in tendon explants. This allowed us to characterize the mechanosensitive properties of tissue-resident tendon cells and identify the mechanical loading states that trigger Ca²⁺ signals in rat tendon explants. We observed that the mechanosensitive response depends both on magnitude and rate of the stretching and found that a slow loading-modality represents an optimal compromise between minimizing tissue loads while maximizing the cellular response.
Then, we asked what type of mechanical stimulus is sensed by tenocytes during tissue stretching. We found shear stress to be a crucial mechanical stimulus for tendon cells by calculating the shear stresses which occur during tissue stretching and applying them to isolated primary tendon cells. We found tight activation limits in vitro and in situ. Then, we combined functional calcium imaging with CRISPR/Cas9 screening and in vivo tenocyte-targeted loss-of-function, and found that the mechanically activated ion channel PIEZO1 is a tendon mechanosensor crucial for shear stressinduced calcium signals. Interestingly, by repeating the shear stress experiment with human bonemarrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) we found similar results, showing that PIEZO1 mediates shear stress also in MSCs. This suggests that PIEZO1-mediated shear sensing may represent a common mechanism shared by stromal cells.
To understand the physiological role of PIEZO1 in tendons, we performed in vitro and in vivo investigations in rodents and humans. Reduced in vivo PIEZO1 mechano-signaling in tenocytetargeted Piezo1 loss-of-function mice decreased the stiffness of tail tendons by 10%. Conversely, elevated PIEZO1 mechano-signaling by recurrent pharmacological PIEZO1-stimulation in tissueresident tenocytes increased the stiffness and strength of rat tendon explants in vitro. This was further verified in vivo by biomechanically characterizing tendons from Piezo1 gain-of-function (Piezo1GOF) mice that express an overactive PIEZO1 causing elevated mechano-signaling. We found a 9% stiffness increase in tail tendons, and an approximately 20% increase in tendon stiffness and strength in the foot flexors of Piezo1GOF mice. The more pronounced phenotype in load-bearing tendons (e.g. foot flexor tendons) compared to positional tendons (e.g. tail tendons) supports the thesis that PIEZO1 drives tissue adaptation according to the mechanical loads applied to the tissue.
Surprisingly, the tendon phenotypes seem not to result from a hypertrophic tissue response as the macroscale tendon morphology and the tendon ultrastructure (i.e. collagen fibrils) remained unaffected. Also, we found that PIEZO1 stimulation in isolated tenocytes does not upregulate but causes a downregulation in the expression and secretion of extracellular matrix (ECM) proteins. Hence, we suspected that the stiffness regulation may be caused by an adjustment of the collagen crosslinking. Indeed, tendons from Piezo1GOF mice demonstrate an elevated thermal stability – a proxy indication of the crosslinking extent – and an increased autofluorescence associated with pyridinoline-crosslinks. Additionally, we found that both pharmacological PIEZO1 activation and mechanical stretching upregulates the gene expression of collagen crosslinking enzymes. Collectively, our data indicate that PIEZO1 regulates the tissue stiffness by adjusting the collagen crosslinking.
The murine Piezo1GOF mutation is similar to a human PIEZO1GOF mutation (known as E756del) which is common in populations of West African descent including African Americans, likely because of its association with malaria resistance. We wondered if humans carrying the PIEZO1GOF mutation E756del show tendon adaptations that influence their athletic performance. Strong, stiff tendons are critical for high physical performance and, interestingly, athletes hailing from countries with high E756del prevalence excel in power sports performance related to sprinting and jumping. However, a potential relevance of the E756del mutation to the latter has not yet been investigated. In a doubleblind human study with US African American participants, we evaluated tendon morphology and tendon-related jumping performance. We found that E756del carriers performed better in a jumping modality that elicits high degrees of tendon loading (i.e. drop counter movement jump, DCMJ) compared to one with lower tendon loading (i.e. counter movement jump, CMJ), while non-carrier controls performed similarly in both jumps. Strikingly, by accounting for the inter-subject jumping variability with the normalization of individual DCMJ to CMJ, we discovered a 13.2% average increase in normalized jumping performance in E756del carriers relative to non-carrier controls. This would likely influence sports performance that rely on sprinting and jumping, nonetheless, whether the E756del mutation is overrepresented in world-class athletes remains unknown.
Next to the work on fundamental processes in tendon mechanotransduction, we harnessed our newly developed imaging setup to investigate the effects of ECM alterations on tenocyte mechanosensitivity. More specifically, we studied whether the ECM glycoprotein SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine) and aging-related ECM changes have an impact on tenocyte mechanosensitivity.
SPARC is highly expressed in tendons and is critical for collagen fibrillogenesis. Its age-related decrease in expression has been hypothesized to favor tissue degenerations and age-induced tendon diseases. However, the role of SPARC in tendons is still poorly understood. We performed stretch-induced calcium imaging experiments with tendon fascicles from Sparc knockout (Sparc-/-) and wild-type mice. Interestingly, we found that a lower mechanical stimulus was sufficient to trigger the calcium response in Sparc-/- fascicles compared to wild-type fascicles. Hence, tenocytes of Sparc-/- mice are more likely to experience hyper-physiological mechanical stimuli. This might explain why Sparc-/- tendons show catabolic adaptations and spontaneous ruptures when subjected to mechanical loading in vivo.
Furthermore, we analyzed the calcium response of fascicles from young (3-month) and old (24-month) mice, as age-related changes in the tendon matrix have been widely described but their influence on mechanosensitivity has not been addressed. Remarkably, we found a clear reduction in mechanosensitivity in old fascicles compared to young ones. This is likely due to a progressive accumulation of advanced glycation end-products (AGEs), which we found to affect the tendon mechanical properties and the kinematics of the collagen fibers and fibrils during tissue stretching. Using confocal microscopy, we observed that AGEs limit fiber-fiber sliding – an important biophysical cue sensed by PIEZO1 in tenocytes – during tissue stretching. Additionally, with synchrotron measurements using small-angle X-ray scattering (SAXS), we observed that at the molecular level AGEs also reduce the sliding between collagen fibrils. Our data suggest a reduced mechanosensitivity in old tendons, possibly caused by age-related ECM changes. The combination of reduced mechanosensitivity and ECM changes might potentially be responsible for the increased risk of tendon injuries and pathologies with aging.
Taken together, using functional calcium imaging we have revealed PIEZO1 to be a major tendon sensor for mechanical stress, that regulates the tissue mechanical properties and affects the human athletic performance. Moreover, by performing calcium experiments with tendons from different mouse models, we demonstrated the versatility of this imaging approach and found that alterations in the ECM composition affect tendon mechanotransduction.
Durante le attività giornaliere o sportive i tendini vengono sottoposti a forze estremamente alte, tra le più alte nel corpo umano. I tendini sono fondamentali per le prestazioni atletiche, poiché essi immagazzinano e rilasciano energia elastica in modo simile ad una catapulta. Per decenni gli scienziati hanno sostenuto l’importanza della stimolazione meccanica per i tendini, dimostrando l’adattamento dei tendini all'esercizio fisico e i benefici dei trattamenti delle patologie tendinee (ad esempio tendinopatie) con esercizi e stimolazione fisica. Le forze a cui i tendini vengono sottoposti rappresentano dunque un fattore di grande importanza per la biologia e fisiologica dei tendini. Tuttavia i meccanismi di regolazione delle proprietà meccaniche tendinee a livello cellulare e molecolare rimangono ancora fino ad oggi sconosciuti.
Per studiare nello specifico questi meccanismi, abbiamo sviluppato un sistema innovativo che permette simultaneamente di applicare tensione ai tendini e di visualizzare la risposta cellulare allo stimolo utilizzando la microscopia fluorescente. Questo sistema ci ha permesso di caratterizzare lo scambio di ioni di calcio (Ca²⁺) che avviene all’interno delle cellule tendinee in seguito a stimolazione meccanica. In questi esperimenti abbiamo osservato che l’applicazione di tensione causa l’attivazione dei segnali di Ca²⁺ nelle cellule. In seguito abbiamo identificato i vari livelli di tensione meccanica necessari per innescare i segnali di Ca²⁺. Questi dati hanno rivelato che la risposta meccanosensibile dipende sia dalla velocità con cui si applica la tensione, sia dalla magnitudine di tensione. Da notare è il fatto che un’applicazione lenta della tensione sembra rappresentare un compromesso ottimale tra la massimizzazione della stimolazione cellulare e la minimizzazione del carico sul tendine, ciò potrebbe rappresentare un approccio ideale per il trattamento di tendinopatie.
Successivamente ci siamo posti la seguente domanda: che tipo di stimolo meccanico viene percepito dalle cellule dei tendini (i tenociti) quando si applica tensione ai tendini? I tenociti risiedono tra lunghe fibre di collagene che scivolano tra di loro quando il tendine è sottoposto a tensione. Abbiamo quindi ipotizzato che lo sforzo tangenziale (o di taglio) causato dallo scivolamento delle fibre possa essere uno stimolo meccano-biologico importante per i tenociti. Per verificare questa ipotesi, abbiamo calcolato i livelli di sforzo tangenziale causati dai movimenti delle fibre e abbiamo sviluppato un sistema che permette di applicare questi stimoli meccanici a tenociti isolati dal tessuto. In effetti, si nota che i tenociti (sia umani che di ratto) sono molto sensibili allo sforzo tangenziale e reagiscono con segnali di Ca²⁺ appena vengono sottoposti a questo tipo di stimolo. Ciò potrebbe indicare che lo sforzo tangenziale rappresenta uno stimolo fondamentale per garantire la corretta omeostasi dei tenociti.
A questo punto ci siamo chiesti quale tra i sensori molecolari fosse responsabile per la percezione dello sforzo di taglio. Per trovare una risposta a questa domanda abbiamo eseguito uno screening CRISPR/Cas9 (tecnologia che permette di effettuare modifiche specifiche al genoma) in combinazione con l'imaging del Ca²⁺ durante l’applicazione di sforzo tangenziale. Questo esperimento ha rivelato che il PIEZO1 è il sensore responsabile per detettare questo tipo di sforzo. PIEZO1 è una proteina che forma un canale cationico nella membrana della cellula e che funge da sensore di forze meccaniche. Quando viene applicata tensione alla membrana cellulare PIEZO1 si apre e lascia passare gli ioni di Ca²⁺ i quali entrano nella cellula. È interessante notare che lo stesso esperimento ripetuto con cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano abbia espresso risultati molto simili. Ciò indica che la percezione dello sforzo tangenziale mediata da PIEZO1 è probabilmente un meccanismo condiviso da tutte le cellule stromali.
Per capire meglio il ruolo fisiologico di PIEZO1 nei tendini abbiamo eseguito degli esperimenti in vitro e in vivo sia con animali che umani. Attivando PIEZO1 farmacologicamente nei tendini di ratto durante 16 giorni di coltura abbiamo riscontrando un aumento di rigidità e resistenza del tessuto. Questi dati suggeriscono che PIEZO1 svolge un ruolo importante nell’adattamento delle proprietà biomeccaniche dei tendini. Per verificare questi risultati in vivo, abbiamo analizzato i tendini di topi portatori di una mutazione genetica chiamata Piezo1GOF, la quale rende PIEZO1 iperattivo e si traduce in ipersensibilità dei tenociti allo sforzo tangenziale. Queste analisi hanno rivelato che i tendini dei topi Piezo1GOF dimostrano un aumento della rigidità e della resistenza di circa il 20% in paragone ai topi senza la mutazione. Un dato interessante se paragonato all’aumento delle proprietà meccaniche osservate nei tendini di atleti rispetto ad individui sedentari, che risulta essere molto simile al risultato delle analisi sui topi.
La mutazione Piezo1GOF dei topi è simile ad una mutazione PIEZO1GOF comune negli umani, nota come E756del, che come la mutazione dei topi anch’essi rende PIEZO1 iperattivo. Abbiamo dunque ipotizzato che, come i topi Piezo1GOF, le persone portatrici della mutazione E756del abbiano tendini più forti. È interessante notare come la mutazione E756del sia particolarmente prevalente nelle popolazioni di discendenza dell’africa occidentale (inclusi gli afroamericani), probabilmente dovuta al fatto che questa mutazione rende i portatori più resistenti alla malaria. Allo stesso tempo si nota che le gare atletiche dei 100 m e 200 m a livello mondiale sono dominate da atleti di discendenza dell’africa occidentale. Un collegamento causale tra le prestazioni atletiche e la mutazione E756del, che probabilmente potenzia i tendini, rimane però sconosciuto.
In un esperimento, in doppio cieco (né i partecipanti né i ricercatori erano a conoscenza del gruppo di appartenenza), abbiamo recrutato partecipanti afroamericani ed esaminato le loro prestazioni di salto, i loro tendini e il loro genotipo (analisi genetica che esamina se la persona è portatrice della mutazione). Per l’analisi delle prestazioni di salto i partecipanti hanno eseguito due tipi di salto diversi. Nel primo salto i partecipanti dovevano saltare più in alto possibile usando una gamba sola. Nel secondo salto dovevano eseguire lo stesso movimento però scendendo da uno scalino alto 20 cm appena prima di saltare più in alto possibile. Con l’aggiunta dello scalino i tendini vengono sottoposti a forze molto più elevate durante il salto. È quindi possibile testare l’influsso di forze molto elevate nei tendini sulla prestazione atletica. Dai dati ottenuti abbiamo scoperto che i portatori di E756del dimostrano una prestazione di salto migliore nel secondo salto, mentre i non-portatori dimostrano una prestazione simile in entrambi i salti. Normalizzando la prestazione del secondo salto alla prestazione del primo salto abbiamo trovato che i portatori di E756del dimostrano un aumento del 13.2% nella prestazione normalizzata del salto. Questi risultati suggeriscono che i portatori di E756del potrebbero avere tendini più forti dal punto di visto biomeccanico, i quali, avrebbero un influsso favorevole sulle prestazioni atletiche (sprint, salti etc.). Ciò nonostante resta da chiarire se l'allele E756del è sovra rappresentato negli atleti d'élite.
Oltre a studiare i meccanismi fondamentali di meccano-trasduzione nei tenociti, abbiamo utilizzato il nostro nuovo sistema di imaging per esaminare il ruolo della matrice extracellulare in questi processi. In particolare abbiamo esaminato se la glicoproteina SPARC e se modifiche alla matrice extracellulare causate dall'invecchiamento hanno un influsso sulla meccano-trasduzione dei tenociti.
SPARC è una proteina altamente espressa nei tendini, anche se la sua funzione a livello molecolare è poco chiara. Analizzando i segnali di Ca²⁺ intracellulari nei tendini dei topi Sparc-/- (topi senza la proteina SPARC) e nei tendini dei topi di controllo, abbiamo scoperto che i tendini dei topi Sparc-/- hanno bisogno di uno stimolo meccanico inferiore rispetto ai controlli per innescare la risposta del Ca²⁺ nei tenociti. Questi dati indicano che i tenociti dei topi Sparc-/- hanno maggiori probabilità di percepire stimoli al di sopra dei livelli fisiologici e spiegherebbero perché i tendini dei topi Sparc-/- dimostrano adattamenti catabolici e rotture spontanee quando sottoposti a carichi meccanici in vivo. Inoltre, paragonando la risposta meccanobiologica di tendini giovani (topi di 3 mesi d’età) e vecchi (topi di 24 mesi) abbiamo scoperto che la meccanosensibilità dei tendini vecchi è chiaramente ridotta.
Ciò è probabilmente dovuto a un accumulo progressivo di prodotti finali della glicazione avanzata (noti come AGEs) che si accumulano nel corso della vita. In effetti, la microscopia confocale ha evidenziato che gli AGEs riducono la viscoelasticità del tendine e limitano i movimenti tra le fibre di collagene. Inoltre, l’utilizzo di raggi X a piccolo angolo di scattering (SAXS, al Paul Scherrer Institute) ha rimarcato che a livello molecolare gli AGEs riducono anche i movimenti tra le fibrille di collagene. Questi cambiamenti nella meccanosensibilità dei tendini sono probabilmente legati ai cambiamenti nella matrice extracellulare e potrebbero essere responsabili per l'aumento di patologie ai tendini e del rischio d’infortunio durante l’invecchiamento.
In conclusione, gli esperimenti con l'imaging funzionale del Ca²⁺ hanno rivelato che il PIEZO1 è un sensore importante nei tendini che reagisce allo sforzo di taglio, regola le loro proprietà meccaniche ed influisce sulle prestazioni atletiche umane. Inoltre, eseguendo esperimenti con tendini di diversi modelli murini, abbiamo dimostrato la versatilità del nostro sistema di imaging del Ca²⁺ e abbiamo scoperto che alterazioni nella composizione della matrice extracellulare influiscono sulla meccanotrasduzione dei tenociti.