Longitudinal bone growth is mediated through endochondral ossification, a process that can be affected by mechanical loading. The regulation of bone growth by mechanical loading is referred to as mechanical modulation of bone growth and is considered to be the underlying factor for the progression of angular developmental deformities, such as juvenile and adolescent scoliosis. Recently, the concept of mechanical modulation has been exploited for development of fusionless treatments of scoliosis by locally modulating vertebral bone growth. Longitudinal bone growth occurs in growth plate cartilage located at the extremities of long bones and vertebrae. Bone growth is the result of a precisely controlled sequence of cell proliferation and differentiation. The growth process starts with chondrocytes at the end of reserve zone of growth plate, which start to divide and proliferate rapidly in a vertical columnar arrangement. After their proliferation stage, chondrocytes undergo hypertrophy, where their volume is increased up to 7 folds. Finally, the cartilage is calcified and invaded by blood vessels. Not only the shape, size and arrangement of chondrocytes are different in the three growth plate zones but the composition of extracellular matrix is also different.

To date, many studies have evaluated the effects of different types of loading on growth plate responses with the purpose of finding the optimal loading condition for fusionless treatments. However still the effects of static vs. dynamic loading and dynamic loading parameters on biomechanical responses and biological responses of growth plate have not been fully identified. The goal of this thesis was to evaluate the effects of static vs. dynamic and dynamic loading parameters on growth plate biomechanical and biological responses. This has been investigated at three levels. First, chondrocytes viability was evaluated in response to each set of parameters. This step allowed identifying the most detrimental sets of parameters. Secondly, the mechanical characteristics of growth plate explants were characterized in terms of tissue strain patterns. Finally, in order to find the relationships between biomechanical properties and main structural proteins of growth plates, the protein content quantification and localization were performed.

Growth plate explants from 4-week old swine were used in this project. The explants were divided into ten experimental groups:​ 1) baseline, 2) control, 3) three static groups and five dynamic groups. Mechanical modulation was performed using a bioreactor maintained in standard culture conditions. After mechanical modulation and culturing or right after dissection for baseline samples, each sample was divided into three parts for the three different levels of study.

The first part of each explant was used for viability assessment. Each part was stained using Calcein AM and Ethidium Homodimer 1 to label live and dead cells, respectively. An automatic image-processing algorithm was used for automatic quantification of the number of live and dead cells. It was observed that the viability was magnitude, duration, frequency, amplitude and zone dependent. The most vulnerable zone was found to be the hypertrophic zone. Also, for longer loading duration, static loading was found more detrimental for chondrocyte viability than dynamic loading. Increment of frequency and amplitude affected the viability of hypertrophic and proliferative zones, respectively. Based on the results of this viability study, only the mechanically modulated groups that showed good viability were further analyzed for their mechanical and biological responses.

The second part of the tissue was used for mechanical characterization and, thereafter, for histomorphological analyses. A combination of confocal microscopy, stress relaxation test and digital image correlation was used for mapping the strain patterns of each explant. First, the samples were labeled using a nucleic acid fluorophore and placed between the platens of a mechanical testing machine placed over the objective of a confocal microscope. A first image was recorded before applying any loading and, after applying a 5% strain and relaxation, a second image was recorded. Digital image correlation was further used to find the displacements and strain patterns between the two states. It was shown that static modulation changes the strain pattern of the tissue in comparison to dynamic modulation, while dynamic loading parameters did not affect growth plate tissue deformational patterns. After mechanical test, the samples were embedded in MMA and stained with Toluidine blue for histomorphometry using a semiautomatic method. No significant differences were found between the thicknesses of the three different zones of growth plate. However, in the static group a loss of columnar arrangement of chondrocytes was observed in hypertrophic and proliferative zones. In the dynamic groups, the columnar arrangements were preserved and the columns of cells were only deviated from the growth direction.

In order to find the relationships between changes in biomechanical properties and structural proteins, aggrecan and collagen contents of the three growth plate zones were quantified using DMMB and Hydroxyproline colorimetric assays in the last part of the study. Moreover, to precisely locate the specific proteins, immunohistochemistry was used with aggrecan, type II collagen and type X collagen antibodies. The reaction signal intensities were quantified using a custom developed image analysis method. In addition, stress relaxation curves were fitted on fibril reinforced biphasic model and the matrix modulus, fibril modulus and permeability of each sample was evaluated. For statically modulated samples, it was established that the increased tissue strain after modulation is related to an increased permeability, which can be related to a loss of proteoglycan in the hypertrophic and proliferative zones of statically modulated samples. Fibril modulus and type II collagen expression was not affected by mechanical modulation. However, type X collagen was found to be the most sensitive extracellular protein to mechanical loading, where its expression was reduced in response to both static and dynamic modulation. Static modulation and dynamic modulation with high amplitude had the most detrimental effects on type X collagen expression.

The first and third hypotheses of this study, stating that:​ “Static and dynamic modulation trigger different effects on chondrocyte viability, and static modulation will be more detrimental for cellular viability” and “Among dynamic modulating parameters, frequency causes the most significant changes in growth plate biomechanical properties and chondrocyte viability compared to loading magnitude” were then rejected. The second hypotheses of the study stating that “Statically and dynamically modulated growth plate explants show different changes in their biomechanical properties and dynamically modulated growth plate explants remain more similar to baseline samples” was confirmed. Finally, the fourth hypotheses stating that “Changes in growth plate biomechanical properties and chondrocyte viability are associated with changes in ECM integrity and tissue and cell histomorphometry” was partly confirmed.

The main limits of this research project are associated with the in vitro approach using a single animal model at one site and at a single developmental stage on a healthy animal model. Moreover, only two variations of each parameter were tested. Also, at viability and mechanical characterization levels, only one test was used and the sample number was found not sufficient to provide conclusive results on protein studies.

Conversely, this study was the first to offer significant information on the effects of static and dynamic loading parameters on cellular viability, biomechanical responses and their relationships to the biological responses of growth plate tissue. Overall, static modulation was shown to be more detrimental for both tissue biomechanical properties and biological responses. Moreover, it was shown that, for longer loading duration, it has more potential for damaging the tissue compared to dynamic loading. This study provides an improved understanding of the fundamental changes in growth plate following mechanical modulation and of the mechanisms of abnormal growth progression in angular developmental deformities. In the long term, this knowledge will be useful for development of treatment approaches based on the local mechanical modulation of bone growth.

La croissance longitudinale des os est gouvernée par l'ossification endochondrale, un processus pouvant être affecté par les chargements mécaniques. La régulation de la croissance osseuse par l’environnement mécanique réfère à la modulation mécanique de la croissance. Ce processus est considéré comme un facteur clé de la progression des déformations angulaires pendant le développement, comme la scoliose juvénile et adolescente. Récemment, le concept de modulation mécanique a été exploité pour le développement des traitements sans fusion de la scoliose en modulant localement la croissance vertébrale. La croissance longitudinale des os s’opère au droit des plaques de croissance situées aux extrémités des os longs et des vertèbres. Elle résulte d'une séquence spatio-temporelle contrôlée des chondrocytes à travers les trois zones (réserve, proliférative, hypertrophique) de la plaque de croissance. Le processus commence par la prolifération des chondrocytes à la limite de la zone de réserve, puis les chondrocytes se divisent et prolifèrent rapidement en formant des colonnes verticales. Après prolifération, les chondrocytes s’hypertrophient;​ leur volume est augmenté jusqu'à 7 fois. Enfin, le cartilage se calcifie et est envahi par les vaisseaux sanguins. La forme, la taille et l’organisation des chondrocytes ainsi que la composition de la matrice extracellulaire sont différentes dans les trois zones de la plaque de croissance.

Dans cette étude, les effets des paramètres de chargement statiques et dynamiques sur les réponses biomécaniques et biologiques de la plaque de croissance ont été étudiés à trois niveaux. Tout d'abord, la viabilité des chondrocytes a été étudiée en réponse à différents paramètres. Cette étape a permis d'identifier l’ensemble des paramètres les moins dommageables pour la viabilité. D'autre part, les caractéristiques mécaniques des explants de la plaque de croissance ont été caractérisées en termes de patrons de déformation du tissu. Enfin, dans le but de trouver les relations entre les propriétés biomécaniques et les protéines structurales principales de la plaques de croissance, les contenus de protéines clés de la matrice extracellulaire ainsi que leur localisation ont été évalués.

Dans ce projet, des explants de plaques de croissance porcines de quatre semaines ont été utilisés. Les explants ont été divisés en dix groupes expérimentaux:​ 1) référence, 2) contrôle, 3) trois groupes statiques et cinq groupes dynamiques. La modulation mécanique a été effectuée en utilisant un bioréacteur sous des conditions standard de culture. Après modulation mécanique et culture tissulaire ou immédiatement après la dissection pour les échantillons de type référence, chaque échantillon a été divisé en trois parties pour les trois niveaux différents d'études.

La première partie de chaque explant a été utilisée pour l'évaluation de la viabilité. Chaque partie a été colorée en utilisant la calcéine AM et l’homodimère d’éthidium 1 pour marquer les cellules vivantes et mortes, respectivement. Un algorithme de traitement d'images a été utilisé pour la quantification automatique du nombre de cellules vivantes et mortes. On a observé que la viabilité est dépendante de la magnitude, la durée, la fréquence, l'amplitude et la zone de la plaque de croissance. La zone hypertrophique a été identifiée comme celle la plus vulnérable. Aussi, pour une plus longue durée de chargement, la modulation statique a été plus dommageable pour la viabilité des chondrocytes que la modulation dynamique. L’augmentation de la fréquence et de l’amplitude a affecté la viabilité dans les zones proliférative et hypertrophique, respectivement. Basé sur les résultats de cette étude de viabilité, seulement les groupes qui ont montré une bonne viabilité ont été analysés pour les études subséquentes mécaniques et biologiques.

La deuxième partie du tissu a été utilisée pour la caractérisation mécanique et, par la suite, pour des analyses histomorphologiques de la plaque de croissance. La microscopie confocale, des tests de relaxation en contrainte et la corrélation d’images ont été combinés pour caractériser les patrons de déformation de chaque explant. Pour ce faire, les échantillons ont d’abord été marqués avec un fluorophore nucléique et placés entre les plateaux de chargement d'un appareil micromécanique installé sur l'objectif d'un microscope confocal inversé. Une première image a été sauvegardée avant d'appliquer le chargement puis une seconde image a été sauvegardée après application d'une déformation de 5%. Un algorithme de corrélation d’images a été utilisé pour évaluer les déplacements et les déformations entre les deux états. Les résultats ont montré que la modulation statique change le patron de déformation du tissu par rapport à la modulation dynamique. Par ailleurs, la modulation avec différents paramètres dynamiques ne modifie pas les patrons de déformation de la plaque de croissance. Suite aux tests mécaniques, les échantillons ont été enrobés dans du plastique puis colorés avec de la toluidine bleu pour des analyses histomorphométriques basées sur une méthode semi-automatique. Aucune différence significative n’a été observée entre les épaisseurs des trois zones de la plaque de croissance. Toutefois, dans le groupe statique, une perte de l’organisation colonnaire des chondrocytes a été observée dans les zones hypertrophique et proliférative. Dans les groupes dynamiques, l’organisation cellulaire en colonne a été conservée mais avec des colonnes légèrement déviées par rapport à la direction de croissance.

Afin de trouver les relations entre les changements de propriétés biomécaniques et de protéines structurelles, le contenu en protéoglycanes et collagène a été quantifié dans les trois zones de la plaque de croissance en utilisant des essais colorimétriques du bleu de diméthyl-méthylène (DMMB) et d’hydroxyproline. De plus, pour localiser précisément les protéines dans la matrice extracellulaire, l’aggrécane, et les collagènes de type II et X ont été marqués par immunohistochimie. Les intensités de réactions ont été quantifiées à l'aide d'une méthode de traitement d'images. Les courbes de relaxation de contrainte ont aussi été recalées par rapport à un modèle biphasique renforcé de fibres pour extraire le module d’élasticité de la matrice, le module des fibres et la perméabilité de chaque échantillon. Pour les échantillons modulés de façon statique, on a observé que l’augmentation de déformation du tissu était reliée à l’augmentation de perméabilité, elle-même pouvant être reliée à la perte de protéoglycanes dans les zones proliférative et hypertrophique des échantillons statiques. Le module de fibres et l'expression du collagène de type II n'ont pas été affectés par la modulation mécanique. Toutefois, le collagène de type X a été plus sensible au chargement mécanique et son expression a été réduite en réponse aux modulations statique et dynamique. Les modulations statique et dynamique avec amplitude élevée ont créé les réductions les plus importantes d'expression de collagène de type X.

Les première et troisième hypothèses de cette étude, indiquant que « Les modulations statique et dynamique ont des effets différents sur la viabilité des chondrocytes, et que la modulation statique est plus dommageable " et que " Parmi les paramètres dynamiques de modulation, la fréquence (par rapport à l'amplitude de chargement) provoque les changements les plus importants sur les propriétés biomécaniques et la viabilité des chondrocytes " ont ainsi été rejetées. La deuxième hypothèse de l'étude indiquant que "Les explants chargés statiquement et dynamiquement montrent différents changements dans leurs propriétés biomécaniques et les explants dynamiques restent plus semblables aux échantillons référence " a été confirmée. Enfin, la quatrième hypothèse indiquant que « Des changements dans les propriétés biomécaniques et la viabilité des chondrocytes sont associés à des changements dans l'intégrité de la matrice extracellulaire et l’histomorphométrie tissulaire " a été partiellement confirmée.

Cette étude est la première à investiguer les effets des paramètres de chargement statique et dynamique sur la viabilité cellulaire des plaques de croissance, leurs réponses biomécaniques et les relations avec leurs réponses biologiques. Dans l'ensemble, la modulation statique est plus dommageable pour les propriétés biomécaniques et la composition biologique de la plaque de croissance. En outre, pour une durée plus longue de chargement, le chargement statique a davantage de potentiel d'endommager la plaque de croissance comparativement au chargement dynamique. Cette étude fournit une meilleure compréhension de la modulation mécanique de la croissance, et des mécanismes impliqués dans la progression des déformations musculosquelettiques. À long terme, ces connaissances seront utiles pour le développement de nouvelles approches de traitement basées sur la modulation mécanique locale de la croissance osseuse.