La croissance osseuse longitudinale s'effectue dans les plaques de croissance situees aux extremites des os longs et des vertebres. La plaque de croissance comprend trois zones successives (reserve, proliferative, hypertrophique), dont la composition, la structure et la morphologie different tant au niveau des cellules que de la matrice extracellulaire. Plusieurs hormones systemiques, facteurs de croissance locaux, facteurs genetiques et nutritionnels, ainsi que des medicaments regulent la croissance osseuse. L'evidence clinique demontre de plus que l'environnement mecanique est necessaire a la croissance osseuse normale. Cependant, les charges excessives peuvent conduire a des anomalies de croissance osseuse ou des conditions pathologiques progressives du systeme musculosquelettique. Parmi les facteurs biologiques d'influence sur le taux de croissance, la synthese/degradation de la matrice extracellulaire de la plaque de croissance, en combinaison avec l'hypertrophie et la proliferation cellulaires, joue un role important dans la croissance osseuse longitudinale, car ses modifications sont necessaires au passage des cellules de la proliferation vers l'hypertrophie.

Un chargement statique in vitro a montre que la production d'ARN messagers (ARNm) des deux principaux collagenes composant la plaque de croissance, le collagene de type II et le collagene de type X, etait diminuee avec le chargement. Cette observation n'a cependant pas ete confirmee lors d'une experimentation in vivo sur un modele animal de poulet. Cette etude ne controlait toutefois pas precisement la charge appliquee tant au niveau de la magnitude de la charge que de sa direction. Par ailleurs, deux etudes in vivo sur des modeles animaux de rats, ont montre qu'un chargement en compression dynamique ne modifiait pas 1'expression des proteines du collagene de type II ni du collagene de type X dans la matrice extracellulaire. Ces etudes qui ont ete menees avec un chargement dynamique et intermittent pourraient induire des reponses biologiques differentes a celles d'un chargement de type statique.

Le present projet avait pour objectif d'etudier in vivo un modele animal de rat soumis a un chargement statique constant et controle avec precision, puis de quantifier la modulation mecanique de la croissance osseuse et de determiner le role de la matrice extracellulaire (sa synthese et/ou sa degradation) dans ce processus de modulation. Afin de remplir cet objectif, un appareil de chargement a ete fixe sur les sixieme (Cd6) et huitieme (Cd8) vertebres caudales de rats males de 28 jours afin de solliciter mecaniquement la septieme vertebre caudale (Cd7) avec une contrainte (force/aire) de 0,2 MPa pendant une periode de 15 jours. Trois groupes experimentaux ont ete etudies :​ un groupe controle, un groupe « sham » (appareil installe mais aucune mise en charge), et un groupe charge. Les rats de chaque groupe ont ete separes en deux sousgroupes pour les differentes analyses biologiques, dans lesquelles les vertebres caudales Cd5 et Cd9 ont fourni des controles internes situes a l'exterieur de l'appareil de chargement. Un premier sous-groupe a ete utilise pour mesurer les taux de croissance des vertebres Cd5, Cd7 et Cd9, a l'aide de deux injections de calceine - un antibiotique qui se lie aux lieux de mineralisation active - prealablement au sacrifice ainsi que pour completer differents essais histologiques. Ces essais ont inclus des immunohistochimies pour caracteriser la distribution du collagene de type II et du collagene de type X, et une coloration a la safranine-0 pour etudier la distribution des proteoglycanes, dans la matrice extracellulaire des plaques de croissance des vertebres Cd5, Cd7 et Cd9. Des mesures histomorphometriques ont egalement ete completees pour la vertebre caudale Cd7. Le second sous-groupe a ete utilise pour des essais de RT-PCR quantitative (qRT-PCR) permettant de quantifier l'expression des genes des trois composants principaux de la matrice extracellulaire (les collagenes de type II et X et l'aggrecane) et de quatre enzymes proteolytiques degradant ces composants (MMP-3 et -13 et ADAMTS-4 et -5).

Les experimentations ont montre que le chargement en compression ralentissait la croissance des vertebres Cd7 du groupe charge de 29% (p<0,05) par rapport au groupe controle et de 15% (p=0,07) par rapport au groupe « sham ». Au niveau de la plaque de croissance, les collagenes de type X et II ont ete moins exprimes dans la matrice du groupe charge que dans celle des deux autres groupes, leurs expressions etant diminuees respectivement dans 50% et 83% des rats charges. Aucune modification significative n'a cependant ete observee pour leurs ARNm ni pour l'une des enzymes proteolytiques capable de les cliver, la MMP-13. Une surexpression significative de 1'autre de leurs enzymes degradatricess testees, la MMP-3, a ete observee pour le groupe charge par rapport au groupe controle (p<0,05) mais pas par rapport au groupe « sham » (p=0,72). Cette surexpression du groupe charge n'a neanmoins pu etre exclusivement associee au chargement, car elle etait tres similaire au groupe « sham ». Le troisieme composant principal de la matrice, l'aggrecane, n'a montre aucun changement dans sa propre distribution, sa production d'ARNm ou celle de ses degradeurs proteolytiques etudies, ADAMTS-4 et -5. Par ailleurs, les etudes histomorphometriques ont montre que la vertebre Cd7 chargee avait un cortex plus large a porosite plus elevee que la meme vertebre dans le groupe controle.

Cependant l'etude a certaines limites dans son design meme, car elle n'a ete menee que sur un petit nombre de rats, en particulier pour le groupe « sham ». Par ailleurs, les resultats ne s'appuient que sur un type d'essai biologique et il faudrait ainsi les confirmer par d'autres types d'essais. De plus, la precision de la charge appliquee par l'appareil presentait certaines limites dans le controle de son intensite et de son orientation. Enfin, le modele animal du rat presentait certains inconvenients, en particulier sa petite taille et la quantite correspondante de tissus pour les essais biologiques.

Cette etude a demontre que le chargement statique in vivo en compression induit un remodelage de la matrice extracellulaire de la plaque de croissance, ce qui pourrait conduire a des modifications des activites cellulaires de proliferation et d'hypertrophie , puis consequemment expliquer la reduction de taux de croissance observee. La nature de cette reorganisation des proteines de la matrice n'a cependant pu etre determinee. Des etudes ulterieures pourraient investiguer la possibilite d'une denaturation mecanique des collagenes, comme il a deja ete observe dans le cas du chargement mecanique du cartilage articulaire, et d'autres stades de chargement pourraient etre investigues pour confirmer les resultats obtenus pour 0,2 MPa. Les connaissances decoulant de ces etudes mecanobiologiques de la plaque de croissance permettront de mieux comprendre le processus de modulation mecanique de croissance et de fournir une base plus scientifique au traitement medical des deformations squelettiques progressives.

Longitudinal bone growth occurs within the growth plate at the end of long bones and vertebrae. The growth plate is divided in three zones (reserve, proliferative, hypertrophic), in which the composition, structure and morphology are different at the cellular level as well as in the extracellular matrix. Several factors, such as systemic hormones, local growth factor, genetics, nutrients and drugs, regulate bone growth. Clinical evidence demonstrates that loads are essential to normal bone growth, yet, if too elevated, these loads can result in skeletal deformities or progressive pathological conditions of the musculoskeletal system. Among the different biological factors influencing growth rate like cellular proliferation and hypertrophy, the synthesis and degradation of the growth plate extracellular matrix has an important role to play in longitudinal bone growth, because the modification of the matrix is necessary for the proliferative cells to undergo their morphological changes and become hypertrophic. A static in vitro loading showed that the mRNA productions of the two main growth plate collagens, type II and X collagens, were reduced with loading. Yet, it was not confirmed by an in vivo study on a chicken model. However, this study did not precisely control the load applied neither in intensity nor in direction. Two other in vivo studies on a rat model observed no change in the expression of the two collagens proteins after a dynamic compressive load. These studies, which were using a dynamic intermittent loading, could have implied a different biological response as compared to those using a static loading.

The present work was aimed to study in vivo a rat animal model under a constant static compressive loading precisely control, to quantify the mechanical bone growth modulation and to determine the role of the extracellular matrix (synthesis and/or degradation) in the modulation process. In order to fulfill this goal, a loading device was fixed on the sixth (Cd6) and the eight (Cd8) caudal vertebrae of male rats 28 days old to mechanically load the seventh caudal (Cd7) vertebra with a stress (force/area) of 0.2 MPa for 15 days. Three experimental groups were studied:​ a baseline control group, a sham group (loading device installed but no load applied), and a loaded group. The Cd5 and Cd9 vertebrae, external to the external fixator, were used as internal controls. In the three groups, the rats were divided in two subgroups for the different biological analysis. A first subgroup was used to measure the growth rates on the Cd5, Cd7 and Cd9 vertebrae, using two calcein -an antibiotic which binds specifically to actively mineralizing matrix- injections made before sacrifice. This subgroup was also used to perform different histological assays, including immunohistochemistries to characterize the type II and X collagens distribution and safranin-0 coloration to study the proteoglycans distribution, in the growth plate extracellular matrix of the Cd5, Cd7 and Cd9 vertebrae. Histomorphometric measures were also performed on the Cd7 vertebra. The second subgroup was used for qRT-PCR assays to quantify the three main extracellular matrix components (type II and X collagens and aggrecan) and four proteolytic enzymes degrading the above mentioned components (MMP-3 and -13 and ADAMTS-4 and -5).

The experimentations showed that the compressive loading reduced the Cd7 growth of the loaded group by 29% (p<0.05) and 15% (p=0.07) as compared to the control group and the sham group, respectively. In the growth plate matrix, the type X and II collagens were less expressed in the loaded group than in the other group in 50% and 83% of the rats, respectively. No significant change was observed neither in the mRNA production of the two collagens nor in MMP-13, one of the proteolytic enzyme studied able to degrade the collagens. A significant over-expression was observed in the loaded group for MMP-3, the second collagens degradative enzyme studied, as compared to the control group (p<0.05), yet the difference was not significant as compared to the sham group (p=0.72).

Then this over-expression in the loaded group could not exclusively be attributed to the load applied, because it was very similar to the expression measured in the sham group. The aggrecan, the third main component studied, did not demonstrate any change in the protein distribution, in the mRNA production or in the mRNA production of the proteolytic degraders studied, ADAMTS-4 and -5. In addition, the histomorphometric studies showed that the loaded Cd7 vertebra had a cortex thicker and porosity more important than the same vertebra in the control group.

The study has a number of limits because it was conducted only in a limited number of rats, especially in the sham group. Moreover, the results are based only on one type of biological assay and hence the use of other techniques would be required to confirm the results. In addition, the accuracy of the load applied with the device was somehow limited in the control of its magnitude and orientation. Finally, the use of the rat animal model includes some disadvantages, mostly because of its small size, and the corresponding amount of tissue for biological assays.

This study showed that an in vivo static compressive loading induces a remodeling of the growth plate extracellular matrix, which could lead to modifications in the proliferative and hypertrophic cellular activities, and in consequence explain the growth rate reduction observed. The nature of the reorganization in the matrix proteins though, was not determined. Following studies could investigate the possibility of a mechanical denaturation of the collagens, as it has already been observed in articular cartilage under mechanical loading. Other loading levels could also been investigated to confirm the results obtained here with 0.2 MPa. The increase understanding in the growth plate mechanobiology that will come from these studies will provide new insights in the mechanical growth modulation mechanism and a more scientific basis for the medical treatments of progressive skeletal deformities.