Quantitativeendpoints have become an important factor of success in biology and biomedical engineering. Classically such endpoints were investigated with 2D imaging tools. The 3D character of tissue lost in suchinvestigations and the applied methods are invasiveand destructive. Moreover, it is known that cells behave quite differently in 2D or 3D environments. Therefore true 3D imaging has gained in importance as a tool for both qualitative and quantitative assessment of biological structures. In this context X-ray tomographyis a very promisingtool. However, the contrast of soft tissue specimen is limited at spatial resolutions in the micrometer ränge. Therefore new 3D methodsare needed for true geometricalvisualization of soft tissue. Additionally, if we are interested to investigate the effect of mechanical forces and displacements,we will need a non-destructive3D technique that can be used in a time-lapsedfashion. All of that is true for X-ray tomography. Nevertheless, if we want to further exploreX-rays as source for advanced3D imaging of bothhard and soft materials, highbrillianceis required. Thus, it is reasonable to assume that cell and cell culture imaging using Synchrotron radiation can close the current gap for X-ray tomography as a hierarchical tool for both soft and hardtissue imaging.

One field of investigation where we would like to apply this approach is osteoporosis research. This disease is characterized by low bone mass, reducedbone stability and increase in fracture risk. Nowadaysit becomes increasingly apparent that besides bone mineral density also microarchitectureand local tissue properties such as microcracks,cell density and cell distribution, and the quality of the organic matrix play an important role for bone stability. Nevertheless, features such as microcracks can currently only be investigatedusing 2D microscopy. Thus a 3D method for the assessment of bone microcracks and bone cells would be advantageous. Additionally,the recently developed technique of image guided failure assessment allows detailed investigation of the bone failure processin a timelapsed fashion. For the assessment of microdamage, tube-based Systems are of insufficient spatialresolution. Thus a device for image guidedfailure assessment for Synchrotronlight would provide the ability to uncoverbone failure in greater detail. Thereforethe overall goals of this thesis are first the developmentof a visualization and analysis scheme for cells in soft and hard tissues requiring new staining techniques;​ second;​to visualize and also analyze microcracks directlyin the 3D bone matrix;​ and third to develop a device for image guided failure assessment in a synchrotron environment.

For the development of a cell stain, a cell culture model system consisting of a polymer yarn seeded with cells was devised as described in Chapter 4. Stains with high absorption, are needed for cell culture visualization;​ the required minimum detectable concentrations in the mmol ränge were calculated. Staining techniques based on osmium tetroxide and a gold-labeledlectin in combinationwith a gold-enhancement Suspension were successfully developed.Retrievedvisualizations from Synchrotron radiation micro-computed tomography were found to be in good agreement with images from conventional techniques such as light and electron microscopy. If the stained sample resulted in low contrast in reconstructedimages, spatial resolution was traded for better contrast. In the model system, both the geometry of the cell culture and the scaffold were segmented and quantified in 3D for the first time. The Variation of the lectin-based staining protocol showed that the quantified parameters depend linearly on the exposure time to the gold-enhancement. Differential absorption contrast applied for such samples showed similar, but so far no additional information. The different morphology of cell cultures of human foreskin fibroblastsand mouse calvaria osteoblast-likecells on the model systems caffold were uncovered qualitatively and quantitatively in 3D for the first time introducing new metrics to demonstrate cell function. Cell Clusters of human embryonic kidney cells were stained for DNA and RNA. In this way cell viability across the Clusterwas quantified and two differentregions were uncovered. The application of the lectin-based staining technique on mouse bone resulted in stained cells mainlyon the bone surface and in the remaining soft tissue around it.

In Chapter 5 microcrack imaging and analysis is discussed. The stain concentrations required for visualization of cells and microcracks in bone were calculated,however they systematically underestimated the truly needed concentrations. For microcracks in bone a stain based on lead- and uranyl-acetate could be used for the quantitative post-hoc analysis of microdamagein 3D. For detection of microcracks in specimen subjected to image guided failure assessment using Synchrotron radiation no stain for microcracks was needed. The spatial resolution was sufficient for direct visualization of the cracks.

In Chapter 6 a new device for synchrotron-based image guided failure assessment is introduced.The device was validatedusing solid aluminum and trabecular bovine bone. Comparingthe mechanical tests of aluminumto similar ones retrieved from a conventional mechanical testing device, the compliance of the new device was measured.After correction, the results from the new device and the conventional testing device were in good agreement. Retrieved 3D visualizations showed bone failure in great detail. Microcracks and microfractures were uncoveredin 3D for the first time. A first algorithm for microcrack Classification was developed and applied. The results suggest that the conventional Classification of microcracks and microfractures from 2D sections is ambiguous.The comparisonof failure of fatigued and non-fatigued trabecular bovinebone revealed that in the case of fatiguedbone the volume-increase of microcracks and microfracturesis greater than in the case of non-fatigued bone. Also the observedburst-like and band-like failurepatterns for fatigued and non-fatiguedbone, respectively,were different.

In conclusion the presented new developments add to existing X-ray tomography experiments making it now possible to perform both qualitative and quantitative analysis of soft and hard tissuesin a static and time-lapsedfashion with micrometer spatial resolution.

Quantitative Endpunkte sind heute ein wichtigerFaktor in der Biologie und in der Biomedizinaltechnik. Normalerweise werden solche Endpunkte mittels zwei¬ dimensionaler bildgebender Verfahren analysiert. Dabei geht nicht nur der dreidimensionaleCharakter des Gewebes verloren, vielmehr sind diese Methoden invasiv und destruktiv. Außerdemist bekannt, dass Zellen sich in einer 2D und 3D Umgebung unterschiedlich verhalten. Daher haben dreidimensionale Bildgebungsverfahren an Wichtigkeitgewonnen, zumal diese für qualitative sowie auchfür quantitative Bildverarbeitunggeeignetsind. Die Röntgentomographieist in diesem Kontext eine viel versprechendeMethode. Jedoch ist der Kontrast von Weichgewebe bei einer Ortsauflösung im Mikrometerbereich limitiert.Daher werden neue dreidimensionale bildgebende Verfahren benötigt. Wenn zusätzlich der Einfluss von mechanischen Kräften in solche Untersuchungenmiteinbezogen werdensoll, dann wird eine nicht destruktivebildgebendeMethodebenötigt, die auch zeitaufgelösteingesetzt werdenkann. Beides trifft für die Röntgentomographie zu. Für solche Untersuchungen and Strukturenim Mikrometerbereich ist eine hohe Brillanz der eingesetztenRöntgenstrahlungnotwendig, die nur von Synchrotron¬ strahlungsquellenerreicht wird. Daher würde die Visualisierungvon Zellkulturen mittels Synchrotronstrahlung die Lücke in der Röntgentomographie als hierarchisches Bildgebungsverfahren von Hart-und Weichgewebenschließen.

Ein Forschungsgebiet, in dem wir diesen Ansatz einbringen wollen, ist die Osteoporoseforschung. Osteoporose ist durch eine geringe Knochenmasse, eine reduzierte Knochenstabilitätund einen Anstieg des Frakturrisikos gekennzeichnet. Heutzutage wird immer mehr klar, dass nicht nur die Knochenmineralisierung, sondern auch die Mikroarchitektur and die lokalen Gewebseigenschaftenwie Mikrorisse, Zelldichte und Verteilungsowie die Qualität der organischen Matrix für stabile Knochen verantwortlichsind. Mikrorissekönnenzur Zeit mit 2D Mikroskopie untersucht werden. Eine Methode für die dreidimensional Erfassung von Mikrorissen und Knochenzellen wäre daher von Vorteil. Überdies erlaubt die kürzlich entwickelte Methode des „Image Guided Failure Assessment", die die Röntgentomographie mit mechanischer Prüfung verbindet, die zeitaufgelöste Untersuchung von Knochenversagen.Für die Erfassung von Mikroschaden sind Systeme, die auf Röntgenröhren aufbauen, begrenzt einsetzbar, da ihre Ortsauflösung ungenügend ist. Aus diesem Grund würde ein Gerät für „Image Guided Failure Assessment", welches an einem Synchrotron einsetzbar ist, es erlauben, das Knochenversagen noch genauer im Detail zu analysieren. Somit könntenlokale Gewebsunterschiedewie Mikroschaden, Zelldichte und Verteilungin. die Analyse des Versagens miteinbezogen werden.

Aus diesem Grund waren die Ziele der vorgestellten Arbeit:​ erstens Zellen in Hartund Weichgewebezu visualisieren und quantifizieren, was die Entwicklung von Kontrastierungsverfahren voraussetzt, zweitens Mikrorisse im Knochen in 3D darzustellen und zu quantifizieren und drittenseine Vorrichtung für „Image Guided Failure Assessment" Experimente an einer Synchrotronstrahlungsquelle zu entwickeln.

Für die Entwicklung eines Kontrastmittels für Zellen wurde, wie in Kapitel 4 beschrieben, ein Zellkultur-Modellsystem benutzt. Für die Visualisierung von Zellkulturen werden Kontrastmittel mit hoher Röntgenabsorptionbenötigt. Die notwendigenminimal detektierbarenKonzentrationen dieser Kontrastmittel, die im mmol Bereich liegen, wurdenberechnet. Kontrastierungsmethodenbasierend auf Osmiumtetraoxidbzw. auf mit Gold markiertem Lektin in Kombinationmit einer Goldverstärkungssuspension konnten erfolgreich adaptiert werden. 3D Bilder von der Röntgentomographiemit Synchrotronstrahlung wurden mit Bildern optischer und Elektronenmikroskopie validiert. Im Falle von niedrigemKontrast kann die Ortsauflösung gegen Kontrast eingetauschtwerden. Für das Modellsystemkonnten sowohl die Geometriedes Zellträgers als auch die der Zellkultur zum ersten Mal in 3D segmentiert und quantifiziert werden. Die Variation des Lektin-basierten Kontrastierungsprotokollszeigte, dass die quantifizierten Parameter linear von der Inkubationszeit der Goldverstärkungssuspension abhängen. Differentieller Absorptionskontrast ergibt bei den untersuchten Proben ähnliche, aber keine zusätzliche Information. Die verschiedenen Morphologien von Fibroblasten der menschlichenVorhaut und Osteoblast-ähnlicherZellen von der Calvariader Maus im Modellsystem konnten zum ersten Mal in 3D qualitativ und quantitativ aufgezeigt werden.In Zellklustern von humanenembryonalenNierenzellenkonnten die DNA und RNAkontrastiertwerden.Auf diese Weise konnte die Zellviabilität im Zellkluster quantifiziert werden, welcher sich in zwei Regionen aufteilt. Die Anwendung des Lektin-basierten Kontrastmittelsim Mäuseknochenresultiertein kontrastierten Zellen, die sich hauptsächlichan der Knochenoberfläche und in Resten von Weichgewebeum den Knochenherum befanden.

Wie in Kapitel 5 dargestelltist, sind neben den Zellen auch die Mikrorisseim Knochen ein wichtigerParameter. Die minimal detektierbaren Konzentrationen von Kontrast¬ mittel im Knochenwurden berechnet, jedoch unterschätzendie so erhaltenenWerte, die tatsächlich benötigten Konzentrationen. Für die post-hoc Analyse von Mikrorissen im Knochen kann ein Kontrastmittel basierend auf Blei- und Uranylacetat eingesetzt werden. In Proben die dem „Image Guided Failure AssessmenfmitSynchrotronstrahlung unterzogenwerden wird für die Detektion von Mikrorissen kein Kontrastmittel benötigt. Die Ortsauflösungist ausreichend um diese direkt darzustellen.

Für „Image Guided Failure Assessment" Experimente wurde ein neues Gerät entwickelt, das in Kapitel 6 vorgestellt wird. Das Gerät wurde mittels solidem Aluminium und trabekulärem Rinderknochen validiert. Der Vergleich vonmechanischen Tests von Aluminium mit ähnlichen Tests an einer Stationären Prüfmaschine erlaubte es, die Verformung des neuen Gerätes zu messen. Die Miteinbeziehung dieser Verformung in die Tests von Rinderknochen ergab im Vergleich mit ähnlichen Tests an der stationären Prüfmaschine eine gute Übereinstimmung der Resultate. Die 3D Visualisierungen zeigten das Knochenversagenim Detail. Mikrorisseund Mikrofrakturen konntenzum ersten Mal in 3D dargestellt werden. Für Ihre Quantifizierung wurde ein erster Algorithmus entwickelt. Resultate legen den Schlussnahe, dass die konventionelleKlassifizierung von Mikrorissen und Mikrofrakturen anhandvon 2D Bilddaten nicht eindeutig ist. Der Vergleich von Versagen von ermüdetem und nicht ermüdetem trabekulären Rinderknochenzeigte, dass im Falle von ermüdetemKnochendie Volumenzunahme von Mikrorissen und -Frakturen größer ist als bei nicht ermüdetemKnochen. Auch das Versagensverhalten charakterisiert durch ein Bruchband im Fall von nicht ermüdetemund durch explosionsartiges Versagenim Fall von ermüdetemKnochen war unterschiedlich.

Zusammenfassendverbessern die neuen Entwicklungendie Röntgentomographiezu einer Methode die es erlaubt Hart- und Weichgewebe in 3D statisch und zeitaufgelöstmit einer Ortsauflösung im Mikrometerbereich zu untersuchen.