Extensive soft tissue defects, such as burn and chronic wounds, frequently require the transplantation of bioengineered skin substitutes. Tissue engineering using autologous patient-derived cells represents the most promising approach towards restoring the full functionality of the affected areas. However, the successful translation of current bioengineered dermo-epidermal skin models to restore all skin functions to the full extent is hampered by several challenges.

Firstly, although many engineered scaffolds enable the ingrowth of peripheral sensory neurons from the host, little to no attention has been given to the inclusion of mechano-sensitive epidermal cells required for fine touch sensation. This is particularly true in the case of spina bifida during fetal development, where the use of acellular scaffolds to close the tissue defect might negatively impact the restoration of sensory functions following a surgical intervention. Merkel cells are of special interest as they transduce tactile stimuli and the relative ease with which they can be isolated and cultured makes them an attractive alternative to other skin-resident sensory corpuscles. The present work described for the first time the isolation and in vitro characterization of fetal Merkel cells. These cells were incorporated into collagen type I-based avascular bioengineered dermo-epidermal skin substitutes, and subsequently transplanted using an in vivo wound healing model. Our results showed that the phenotype and functionality of Merkel cells can be retained both in vitro and in vivo, thus providing the basis for a full restoration of fine touch sensation following certain surgical interventions in utero.

The production time required for such dermo-epidermal skin substitutes can last up to 4 weeks. This constitutes a significant drawback and might hinder their translation into clinics. We addressed the problem of slow in vitro maturation of bioengineered skin in a second study, using a novel bioreactor setup that applied cyclic stretch to bioengineered, physically crosslinked collagen scaffolds. Application of cyclic stretch significantly increased both fibroblast proliferation and production of extracellular matrix proteins, thereby reducing the pre-conditioning time required for optimal keratinocyte adhesion and subsequent formation of a stable epidermal layer.

Successful translation of bioengineered tissue is crucially dependent on its successful perfusion with blood in order to provide nutrients and oxygen to the transplant and mediate inflammatory processes to aid in the wound healing response. Recently, the important role of lymphatics in modulating the immune response and restoring tissue homeostasis during wound healing has gained more attention as well. Most bioengineered skin models, however, still lack a well-developed and mature blood and lymphatic plexus. The second part of this thesis thus aimed at the co-engineering of blood and lymphatic microvascular networks, and characterization of their role following the host immune response. To this end, in a third study we focused on developing a novel sorting strategy which allowed us to isolate blood (BECs) from lymphatic endothelial cells (LECs) using fluorescence activated cell sorting. Furthermore, we demonstrated consistent expression of the immunomodulatory membrane glycoprotein CD200 on BECs and LECs, both in vitro and in vivo. In a related study, we successfully characterized the immunomodulatory activity of the cell adhesion molecule CD157 on a mixed population consisting of BECs and LECs called human dermal microvascular endothelial cells (HDMECs). Compared to CD200+ endothelial cells, prolonged in vitro culturing of CD157+ endothelial cells resulted in rapid downregulation of the marker expression. Our analysis showed that engineered microvascular networks enriched for either cell type led to improved immune cell trafficking as well as innate immune responses in vivo.

Lastly, in a fifth study, we aimed at improving the versatility of native collagen type I hydrogels for the purpose of vascular tissue engineering. To this end, a covalent modification of the collagen backbone was introduced that enabled bio-orthogonal enzymatic crosslinking using the two enzymes sortase A (SrtA) and Factor XIII (FXIII). Bulk hydrogels that were produced by exploiting the enzymatic activity of SrtA supported the tunable neovascularization with blood and lymphatic vascular networks by modulating the hydrogel stiffness or by using variable input ratios of BECs and LECs, respectively. Furthermore, the use of FXIII as an orthogonal crosslinking enzyme was successfully used to demonstrate the concomitant tethering of the proangiogenic QK peptide to the collagen backbone during hydrogel formation, thus providing a means for vascular outgrowth in the absence of exogenous growth factors. Furthermore, collagen hydrogels with spatially defined polymer compositions or microporosity based on secondary annealing of microgels demonstrated the broad versatility of orthogonally crosslinked collagen for the bioengineering of blood and lymphatic microcapillary networks.

Grössere Gewebedefekte, wie sie in Brand- oder chronischen Wunden zu finden sind, benötigen oftmals eine Transplantation artifizieller Haut. Das Tissue Engineering – auch als Gewebezüchtung bezeichnet – bedient sich autologer, vom Patienten stammender Zellen und bietet damit einer der erfolgversprechendsten Ansätze zur vollen Wiederherstellung der Funktionalität ehemals geschädigter Hautareale. Jedoch ist die erfolgreiche klinische Übertragung von künstlich erzeugten dermalepidermalen Hautsubstituten derzeitig noch mit einigen Problemen behaftet.

Obschon viele im Labor künstlich erzeugte Hautgewebsmodelle das Einwachsen von peripheren sensorischen Neuronen des Patienten zulassen, wurde dem Einschluss von mechanisch sensitiven Zellen zur Berührungsempfindung in das Hautkonstrukt bisher noch wenig Beachtung geschenkt. Dies gilt im Besonderen im Falle von fötaler spina bifida (Spaltwirbelsäule), bei welcher die Benützung von nicht zellulärem Gewebe zur Schliessung des Gewebedefekts im Zuge eines operativen Eingriffs negative Folgen für die Wiederherstellung von sensorischen Funktionen haben kann. Merkelzellen sind hierbei von besonderem Interesse da sie Berührungsimpulse weiterleiten können. Verglichen mit anderen sensorischen Korpuskeln lassen sich diese Zellen zudem leicht isolieren und kultivieren. Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt zum ersten Mal die Isolation und Charakterisierung von fötalen Merkelzellen unter Zellkulturbedingungen. Diese Zellen wurden anschliessend in nicht vaskularisierte dermal-epidermale Hautsubstitute auf Kollagen-basis eingebracht und in einem Wundheilungsmodell in Tierversuchen studiert. Die Studienresultate zeigen, dass Merkelzellen ihre Identität als auch Funktionalität sowohl unter Zellkulturbedingungen als auch in dem Tiermodell behalten. Hiermit wird die Grundlage zur Wiederherstellung der Berührungsempfindlichkeit nach chirurgischen Eingriffen in der Gebärmutter gewährleistet.

Unsere früheren Resultate haben gezeigt, dass die Produktionszeit von dermalepidermalen Hautsubstituten bis zu 4 Wochen betragen kann. Dies stellt einen signifikanten Nachteil dar, welcher die klinische Anwendung dieser Methode behindern kann. Wir haben uns im Rahmen einer zweiten Studie mit dem Problem des langsamen Wachstums unter Zellkulturbedingungen beschäftigt. Im Rahmen vii dessen haben wir einen Bioreaktor verwendet, welcher eine zyklische Spannungsbelastung auf künstlich hergestellte Haut ausübt, welche wiederum auf physikalisch quervernetztem Kollagen basiert. Die Anwendung einer solchen zyklischen Spannung hat die Wachstumsrate und die Sekretion von Matrixproteinen bei Fibroblasten signifikant erhöht. Dadurch hat sich die Vorlaufzeit, welche für eine erfolgreiche Etablierung einer stabilen epidermalen Zellschicht benötigt wird, erniedrigt.

Die erfolgreiche Übertragung von künstlich hergestellter Haut in die Klinische Anwendung hängt in bedeutendem Ausmass von der Perfusion von Blutgefässen ab. Solche wiederum werden benötigt um die transplantierte Haut mit Nährstoffen sowie Sauerstoff zu versorgen. Zudem dienen diese als Vermittler von Entzündungsprozessen während der Wundheilung. Neueste Forschungsergebnisse haben zudem gezeigt, dass auch die lymphatischen Kapillaren eine bedeutende Rolle in der Immunantwort spielen und an der Wiederherstellung der Gewebshomeostase beteiligt sind. Die Mehrheit der künstlich entwickelten Hautmodelle enthalten jedoch kein gut entwickeltes und maturiertes Blut- und Lymphkapillarnetzwerk. Der zweite Teil dieser Arbeit zielt deshalb darauf ab, parallele Blut- und Lymphkapillarnetzwerke zu entwickeln und deren Rolle in der Immunantwort zu studieren. Hierzu haben wir uns in einer dritten Studie darauf konzentriert eine neuartige Sortierstrategie zur Auftrennung und Isolation von Blutendothelzellen (BECs) und Lymphendothelzellen (LECs) mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung zu entwickeln. Zudem haben wir die kontinuierliche Expression des Immunantwort modulierenden Zelloberflächen Glykoproteins CD200 auf BECs und LECs auf der Zellkulturschale und in transplantierter Haut nachgewiesen. In einer damit verbundenen Studie haben wir erfolgreich die immunmodulierenden Eigenschaften des Zelladhäsionsmoleküls CD157 in einer gemischten Endothelzellpopulation bestehend aus BECs und LECs charakterisiert. Zellen, welche zu dieser gemischten Population gehören werden als humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMECs) bezeichnet. Im Vergleich zu CD200- positiven Zellen hat sich bei CD157-positiven Zellen gezeigt, dass eine lange Kultivierungsdauer auf der Zellkulturschale zu einer stark reduzierten Expression des Proteins CD157 führt. Unsere Analyse in Tierstudien hat gezeigt, dass die künstlich erzeugten mikrovaskulären Netzwerke, welche aus Endothelzellen generiert wurden, welche für CD157+ oder CD200+ Endothelzellen angereichert waren, eine verbesserte Immunantwort aufweisen.

In einer fünften Studie haben wir schliesslich versucht die Einsatzfähigkeit von nativem Kollagen des Typs I für die künstliche Erzeugung von mikrovaskulären Blutund Lymphkapillaren zu verbessern. Zu diesem Zweck wurde eine kovalente Modifikation in das Kollagenmolekül integriert. Diese ermöglichte es sodann, das Kollagen selbst und weitere Moleküle mittels den beiden, in orthogonaler Weise agierenden Enzyme Sortase A und Faktor XIII, quer zu vernetzen. Zuerst wurde die Enzymaktivität von Sortase A dazu verwendet Hydrogele herzustellen, welche in Bezug auf ihre Festigkeit moduliert werden konnten und damit eine Einstellung der sich entwickelnden Blut- und Lymphkapillaren zuliess. Weiterer Einfluss auf die relative Abundanz von Blut- und Lymphkapillaren wurde mittels des Verhältnisses von BECs und LECs während der Herstellung der Hydrogele genommen. Zudem konnte die Enzymaktivität von FXIII erfolgreich dazu verwendet werden, um das provaskuläre QK-Peptid während der Herstellung des Hydrogels an das Kollagengerüst zu konjugieren. Dies erlaubte Endothelzellwachstum und Migration in der Absenz von externen Wachstumsfaktoren. Zudem erlaubte dies die Herstellung von Hydrogelen mit räumlich definierten Polymerzusammensetzungen herzustellen. Zudem konnten Hydrogele mit makroporöser Zusammensetzung basierend auf der sekundären enzymatischen Konjugation von Mikrogelen zur Entwicklung von Blutund Lymphkapillaren hergestellt werden.