Oblique Plane Microscope (OPM) system is an emerging variation of light-sheet microscopy that offers ultra gentle illumination, versatile mounting options and rapid volumetric imaging speed to probe 3D tissue structures. Fluorescent microscopy has long been an important and powerful tool for the biological sciences due to its capability to differentiate subcellular components at high resolution. However, when applied to the field of tissue engineering, where we need to image cellular behaviour in large 3D structures, traditional confocal microscopy is severely limited in image acquisition speed at depth, while avoiding sample photobleaching. In contrast, light-sheet microscopy can achieve faster imaging throughput and lower photobleaching but suffers from limited tissue mounting options. OPM system were developed to address this limitation, as they utilize one single objective for both illumination and image acquisition, which allows for a wide range of sample preparation formats. Adding one rotational scanning mirror allows for fast optical slicing, and hence enables quick scanning of large tissues. Therefore, OPM systems present significant advantages for applications such as rapid quality control in brain organoid processing.

This equipment development thesis provides a complete, step-by-step recipe to build, control and operate a customized OPM system based on Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (SCAPE 2.0) microscope, with sample mounting options designed for quality control analysis of developing brain organoids. The system was designed to house three commonly used colour channels, Blue Fluorescent Protein (BFP) with excitation/emission at 375/460nm, Green Fluorescent Protein (GFP) at 488/525nm and Red Fluorescent Protein (RFP) at 561/620nm. In addition, a bright-field imaging system for sample location was customized and a commercial zoom lens was utilized to achieve magnifications ranging from 9.31X to 26.67X. Finally, the system was synchronized using MATLAB to achieve maximum imaging throughput. The imaging capabilities of the customized OPM system were demonstrated by using midbrain organoids during early developmental stages at which neural rosettes first form. The results showed that imaging depth of more than 200 μm can be achieved with laser power as low as 3 mW and exposure time as short as 10 ms. Such results were comparable to those obtained from the much more time-consuming process of optically clearing brain organoids, and imaging them using conventional confocal microscopy. Overall, this works provides a road map for novices to construct a low cost OPM system with capabilities to rapidly and gently image structures within large, versatile tissue samples

Le système de microscope à plan oblique (OPM) est une variation émergente de la microscopie à feuille de lumière qui offre une illumination ultra douce, des options de montage polyvalentes et une vitesse d'imagerie volumétrique rapide pour sonder les structures tissulaires 3D. La microscopie fluorescente a longtemps été un outil important et puissant pour les sciences biologiques en raison de sa capacité à différencier les composants subcellulaires à haute résolution. Cependant, lorsqu'elle est appliquée au domaine de l'ingénierie tissulaire, où nous devons imaginer le comportement cellulaire dans de grandes structures 3D, la microscopie confocale traditionnelle est gravement limitée en termes de vitesse d'acquisition d'image en profondeur, tout en évitant le photoblanchiment de l'échantillon. En revanche, la microscopie à feuille de lumière peut atteindre un débit d'imagerie plus rapide et un photoblanchiment moindre, mais souffre d'options de montage tissulaire limitées. Les systèmes OPM ont été développés pour remédier à cette limitation, car ils utilisent un seul objectif pour l'éclairage et l'acquisition d'image, ce qui permet une large gamme de formats de préparation d'échantillons. L'ajout d'un miroir de balayage rotatif permet une découpe optique rapide et donc un balayage rapide de grands tissus. Par conséquent, les systèmes OPM présentent des avantages significatifs pour des applications telles que le contrôle de qualité rapide dans le traitement d'organoïdes cérébraux.

Cette thèse de développement d'équipement fournit une recette complète et étape par étape pour construire, contrôler et faire fonctionner un système OPM personnalisé basé sur un microscope d'Excitation Planaire Confocale Alignée Balayée (SCAPE 2.0), avec des options de montage d'échantillons conçues pour l'analyse de contrôle de qualité des organoïdes cérébraux en développement. Le système a été conçu pour abriter trois canaux de couleur couramment utilisés, la protéine fluorescente bleue (BFP) avec une excitation/émission à 375/460 nm, la protéine fluorescente verte (GFP) à 488/525 nm et la protéine fluorescente rouge (RFP) à 561/620 nm. De plus, un système d'imagerie en champ clair pour la localisation d'échantillons a été personnalisé et une lentille de zoom commerciale a été utilisée pour atteindre des agrandissements allant de 9,31X à 26,67X. Enfin, le système a été synchronisé à l'aide de MATLAB pour atteindre un débit d'imagerie maximal. Les capacités d'imagerie du système OPM personnalisé ont été démontrées en utilisant des organoïdes de la région mésencéphalique pendant les premiers stades de développement, au cours desquels les rosettes neurales se forment pour la première fois. Les résultats ont montré qu'une profondeur d'imagerie de plus de 200 μm peut être atteinte avec une puissance laser aussi faible que 3 mW et un temps d'exposition aussi court que 10 ms. De tels résultats étaient comparables à ceux obtenus à partir du processus beaucoup plus long de clarification optique des organoïdes cérébraux et de leur imagerie en utilisant une microscopie confocale conventionnelle. Dans l'ensemble, ce travail fournit une feuille de route pour les novices pour construire un système OPM à faible coût avec des capacités pour imager rapidement et en douceur les structures dans de grands échantillons de tissus polyvalents