The extracellular matrix (ECM) is the non-cellular component of tissues and is made up primarily of collagen type 1. Recent studies implicate ECM stiffening as a predictor and driver of metastases in breast cancer, but while changes in collagen organization or protein content can alter the stiffness and function of the ECM, the mechanisms by which tissue stiffen in the context of breast cancer remain unclear. Clinical measurements of tissue stiffness in metastatic patient samples do not consistently demonstrate increased zonal stiffness, suggesting a transient stiffening mechanism may be at play. Here, we hypothesize that neutrophil extracellular traps (NETs), webs of DNA sprayed out by neutrophils, can transiently stiffen the ECM sufficiently to prompt invasion of cancer cells. We induced the formation of NETs in reconstituted collagen gels through stimulation of isolated neutrophils with Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and noted that the pore sizes of 3D biomaterials limit NET dispersion into the matrix, suggesting that NETs may interact with collagen to stiffen the matrix. We then found significant increases in both bulk and local stiffness, as measured via rheometry and optical magnetic twisting cytometry, respectively. However, stiffness is unchanged when NETosis was induced, and NETs were added to collagen pre-gelation suggesting a localization requirement between neutrophil contents and NETs to stiffen collagen. We then asked whether specific NET sources may differently affect stiffness or breast cancer behaviour. Immature low-density neutrophils (iLDNs), a neutrophil sub-population more prevalent in mice with cancer, has been associated with increased metastases, compared to high-density neutrophil (HDN) populations in healthy mice. To determine whether these neutrophil phenotypic differences may affect breast cancer invasion, we engineered a model system consisting of an array of engineered Src-inducible breast cancer spheroids, embedded within collagen matrices that can invade into the matrix on demand. Invasion was significantly more pronounced into collagen matrices with neutrophil contents, particularly in neutrophil contents from iLDNs after controlling for the number of neutrophils present. Together, this in vitro study suggests that neutrophil extracellular traps, particularly those that are associated with the presence and progression of cancer, may play a previously unsuspected role in transient biophysical regulation of cancer metastasis. These findings suggest novel biophysical mechanisms by which cancer progresses, and potential therapeutic targets with which to limit cancer metastasis

La matrice extracellulaire (MEC) est la composante non cellulaire des tissus et se compose principalement de collagène de type 1. Des études récentes impliquent la rigidité de la MEC comme facteur prédictif et moteur de métastase dans le cancer du sein, et les changements dans l’organisation du collagène ou la teneur en protéines altèrent la rigidité et la fonction de la MEC, par contre leur implication dans les méchanismes de rigidification dans le contexte du cancer du sein demeure incertaine. Les mesures cliniques de la rigidité des tissus dans les échantillons de patients métastatiques ne démontrent pas systématiquement une augmentation de la rigidité zonale, ce qui suggère qu’un mécanisme de raidissement transitoire pourrait être en jeu. Nous émettons l’hypothèse que la nétose (NET), la projection de réseaux d’ADN par les neutrophiles, peuvent raidir la MEC de façon transitoire et suffisante pour favoriser l’invasion des cellules cancéreuses. Nous avons induit la formation de NET dans des gels de collagène reconstitués en stimulant des neutrophiles isolés avec du 13-acétate-12-myristate de phorbol (AMP) et avons remarqué que la taille des pores des biomatériaux 3D limite la dispersion des NET dans la matrice, ce qui suggère que les NET peuvent interagir avec le collagène pour rigidifier la matrice. Nous avons ensuite constaté des augmentations significatives de la rigidité globale et locale, mesurées respectivement par rhéométrie et cytométrie par torsion magnétique optique. Des effets similaires ont été observés en incorporant des NET purifiées, provenant d’une culture standard, pendant la formation du gel. Nous nous sommes ensuite demandé si des sources spécifiques de NET pourraient affecter différemment la rigidité. Les neutrophiles immatures de faible densité (NiFD), une sous-population de neutrophiles plus répandue chez les souris atteintes de cancer, a été associée avec une augmentation de métastases, par rapport aux populations de neutrophiles de haute densité (NHD) chez les souris saines. Bien que nous contrôlions le nombre de NET produites par ces deux sous-populations, nos données préliminaires suggèrent des différences provisoires dans la rigidité des tissus en incorporant ces NET dans des gels de collagène, ce qui suggère des différences de composition entre ces NET qui pourraient affecter la rigidité des tissus. Enfin, pour déterminer si ces différences de rigidité peuvent affecter l’invasion du cancer du sein, nous avons conçu un système modèle consistant d’un ensemble de sphéroïdes de cancer du sein inductibles par l’oncogéne Src, incorporés dans des matrices de collagène qui peuvent envahir la matrice sur demande. L’invasion était significativement plus prononcée dans les matrices de collagène renforcées par des NETs, en particulier provenant des NiFD après contrôle du nombre de NETs présentes. Cette étude in vitro suggère que la nétose, en particulier associée à la présence et à la progression du cancer, peut jouer un rôle insoupçonné auparavant dans la régulation biophysique transitoire des métastases cancéreuses. Ces résultats suggèrent de nouveaux mécanismes biophysiques par lesquels le cancer progresse, ainsi que des cibles thérapeutiques potentielles permettant de limiter les métastases cancéreuses