Background:​ Age-associated fibrotic diseases significantly contribute globally to elevated morbidity, mortality, and financial burdens. Fibrosis, a pathological response mirroring the wound healing process, is characterized by the aberrant accumulation of extracellular matrix components (most notably collagen type I), which can affect single or multiple organs. Transforming growth factor-beta is the master regulator of fibrosis, which orchestrates the activation of fibroblasts into myofibroblasts, α-smooth muscle actin positive contractile non-smooth muscle cells, and key cellular effectors in the fibrotic process. TGF-β also confers myofibroblast apoptosis resistance, amplifying extracellular matrix components synthesis and deposition. Eliminating the cause of injury, deactivating myofibroblasts, and extracellular matrix remodeling would be required for fibrosis reversal. Notably, current treatments fail to reverse fibrosis. Mesenchymal stromal cells (MSC) have potential therapeutic value in fibrosis reversal due to their anti-inflammatory, pro-angiogenic, and anti-fibrotic properties. The MSC therapeutic effects are predominantly mediated through secreted soluble molecules and extracellular vesicles constituting the MSC secretome.

Aging is coupled with a progressive decline and impairment of function at the molecular, cellular, tissue, and organismal levels, explaining the increased risk of disease and death. Senescent cells accumulate in age-associated diseases, including prevalent age-associated fibrotic diseases (i.e., pulmonary fibrosis). Senescence is a cellular response or program that limits the expansion of aged or damaged cells. Senescent cells acquire an inflammatory senescent-associated secretory phenotype;​ therefore, aging is associated with chronic low-grade inflammation, which fosters the fibrotic process. Knowing that senescent MSC have reduced immunomodulatory and pro-angiogenic properties and that senescence is implicated in fibrosis, we hypothesized that replicative senescence changes the MSC secretome, impairing its anti-fibrotic effects and contributes to fibrotic diseases. To test this, we optimized in vitro anti-fibrotic assays that evaluated different phases of the fibrotic process, characterized non-senescent (NS-) and senescent (S-) MSC and their secretome, and compared the in vitro anti-fibrotic effects of NS- and S-MSC secretome.

Methods:​ Adipose-derived MSC were isolated from 6 adult donors undergoing programmed surgery and characterized according to the criteria proposed by the International Society for Cellular Therapy. Characterizing S-MSC was a prerequisite for collecting MSC-conditioned media for subsequent experiments. Replicative senescence was confirmed with a multi-marker approach:​ percentage of senescence-associated betagalactosidase positive cells, doubling time, side scatter, autofluorescence, density of surface CD26, and p16 expression. To evaluate the secretome, conditioned media from NS-MSC and S-MSC collected, and their capacity to modulate fibrosis was assessed in four in vitro assays:​ (1) inhibition of transforming growth factor beta-induced fibroblast activation;​ (2) myofibroblast deactivation;​ (3) myofibroblast apoptosis sensitization, and (4) areal contraction assay. Readouts of these assays included protein quantification by western blotting (α-smooth muscle actin and procollagen I), flow cytometry (Annexin V and DRAQ7), and percent of contraction.

Results:​ Replicative senescence impaired MSC immunomodulatory capacity;​ however, it did not affect the anti-fibrotic effects of MSC-conditioned media in vitro. S-MSC conditioned media inhibited transforming growth factor beta fibroblast activation and deactivated myofibroblasts without inducing fibroblasts’ cell death. MSC-conditioned media (NS- and S-) did not restore myofibroblast apoptosis sensitivity, and both enhanced fibroblasts’ contraction similarly.

Conclusions:​ In vitro assays allow for assessing the MSC secretome anti-fibrotic effects. The S-MSC secretome has preserved in vitro anti-fibrotic properties. These findings suggest potential compensatory mechanisms in S-MSC exist and that while senescence impairs the MSC immunomodulatory properties, it does not influence MSC anti-fibrotic effects in vitro.

Contexte:​ Les maladies fibrotiques associées à l'âge apparaissent de plus en plus comme un contributeur important à une morbidité, une mortalité et un fardeau financier élevés à l'échelle mondiale. La fibrose, une réponse pathologique reflétant le processus de cicatrisation des plaies, est caractérisée par l'accumulation aberrante de composants de la matrice extracellulaire (notamment le collagène de type I), qui peuvent affecter un ou plusieurs organes. Dans ce contexte, le facteur de croissance transformant bêta est le principal régulateur de la fibrose, qui orchestre l'activation des fibroblastes en myofibroblastes, l'actine des muscles lisses positive des cellules musculaires contractiles non lisses, sont des effecteurs cellulaires clés dans le processus fibrotique. Le facteur de croissance transformant bêta confère également une résistance à l'apoptose des myofibroblastes, amplifiant la synthèse et le dépôt de le composants de la matrice extracellulaire. L'élimination de la cause des blessures, la désactivation des myofibroblastes et le remodelage de la composants de la matrice extracellulaire sont essentiels à l'inversion de la fibrose, mais les traitements actuels ne parviennent pas à inverser la fibrose. Cependant, les cellules stromales mésenchymateuses multipotentes humaines (CSM) sont apparues comme une thérapie cellulaire prometteuse, possédant des propriétés anti-inflammatoires, pro-angiogéniques et antifibrotiques. Ces effets thérapeutiques sont principalement médiés par la sécrétion de molécules solubles et de vésicules extracellulaires constituant le sécrétome des CSM.

Le vieillissement est le déclin progressif et l'altération des fonctions aux niveaux moléculaire, cellulaire, tissulaire et organisme, associés à un risque accru de maladie et de décès. Les cellules sénescentes s'accumulent dans les maladies liées à l'âge, y compris les maladies fibrotiques prévalentes associées à l'âge (c'est-à-dire la fibrose pulmonaire). La sénescence est une réponse ou un programme cellulaire qui limite l'expansion des cellules âgées ou endommagées. Les cellules sénescentes acquièrent un phénotype sécrétoire associé à la sénescence inflammatoire;​ par conséquent, le vieillissement est associé à une inflammation chronique de faible intensité, qui favorise le processus fibrotique. Sachant que les CSM sénescentes ont des propriétés immunomodulatrices et pro-angiogéniques réduites et que la sénescence est impliquée dans la fibrose, nous avons émis l'hypothèse que la sénescence réplicative modifie le sécrétome des CSM, altérant ses effets anti-fibrotiques et contribuant aux maladies fibrotique. Pour tester cela, nous avons optimisé les tests antifibrotiques in vitro qui ont évalué différentes phases du processus fibrotique, caractérisé les CSM non sénescentes (NS-) et sénescentes (S-) et leur sécrétome, et comparé les effets antifibrotiques in vitro de le sécrétome des NS- et S-CSM.

Méthodes:​ Les CSM d'origine adipeuse ont été isolées chez 6 donneurs adultes subissant une intervention chirurgicale programmée et caractérisées selon les critères proposés par la Société internationale de thérapie cellulaire. La caractérisation des SCSM était une condition préalable à la collecte les sécrétome des CSM afin de mener toutes les expériences ultérieures. La sénescence réplicative a été confirmée par la présence de marqueurs:​ pourcentage de cellules positives à la bêta-galactosidase associée à la sénescence, temps de dédoublement, diffusion latérale, autofluorescence, densité de surface CD26 et expression de p16. Les sécrétome des CSM provenant des NS-CSM et S-CSM ont été collectés, et leur capacité à moduler la fibrose a été évaluée dans quatre tests in vitro:​ (1) inhibition de l'activation des fibroblastes induite par le facteur de croissance transformant bêta;​ (2) désactivation des myofibroblastes;​ (3) sensibilisation à l'apoptose des myofibroblastes et (4) areal contraction des fibroblastes. Les résultats de ces tests étaient les suivants:​ (1, 2) analyse par western blot (l'actine des muscles lisses et procollagène I);​ (3) cytométrie en flux (Annexine V et DRAQ7) ;​ et (5) pourcentage de contraction.

Résultats:​ Bien que la sénescence réplicative ait altéré la capacité immunomodulatrice des CSM, elle n’a pas altéré les effets antifibrotiques des sécrétome des CSM in vitro. Les sécrétome des S-CSM ont inhibé l'activation des fibroblastes le facteur de croissance transformant bêta et désactivé les myofibroblastes, sans induire la mort des cellules des fibroblastes. Les sécrétome des CSM (NS- et S-) n'ont pas restauré la sensibilité à l'apoptose des myofibroblastes et ont également amélioré la contraction des fibroblastes.

Conclusions:​ Les tests in vitro permettent d'évaluer les effets antifibrotiques du sécrétome des CSM. In vitro, les propriétés anti-fibrotiques du sécrétome des S-CSM sont préservées. Ces résultats suggèrent qu’il existe des mécanismes compensatoires potentiels dans les S-CSM, et même si la sénescence altère les propriétés immunomodulatrices des CSM, elle n’influence pas leurs effets antifibrotiques in vitro.