Adeno-associated viruses exist as a class of virus that have shown promising characteristics as gene therapy vectors. They have further been shown in some instances to also illicit a strong immune response against more threatening viruses like the human immunodeficiency virus. All this interest has led to seek ways to optimally produce these vectors. In mammalian cells, these vectors have been produced in a number of cell culture platforms including HEK293 and HeLa cells. They have been produced using adenovirus vectors, herpes vectors and/or plasmids. Although recent improvements in the ability to produce these vectors at a reasonable scale in suspension by transient transfection have been reported, their production in insect cells using baculoviruses still promises to be one of the most efficient and scalable platforms to achieve the goal of producing enough material for clinical trials. The system was originally described in a seminal paper on the subject in 2002 (Urabe et al., 2002). Starting with what was known at the time, the system was designed so that the Rep78 protein was attenuated and that both the Rep52 protein and the capsid proteins were highly expressed. This was achieved by putting the former under a truncated insect cell immediate early promoter and the latter under insect cell polyhedrin promoters. With an adjustment to the genetic sequence of the capsid proteins, Urabe et al. (2002) were able to mimic the proper stoichiometry of the viral particle proteins. The combination of three baculovectors containing the Rep genes, the Cap gene and the transgene of interest showed excellent results with expression levels and per cell synthesis surpassing what was generally achieved in adherent cell culture using transfection.

To optimize the cellular and volumetric production a detailed characterization of the system was undertaken. To gauge the effect of each baculovirus vector used for the production of AAV vectors, the quantity of each, the ratio between them and the time at which they were added, were investigated. The highest titers were achieved when BacRep and BacCap were added at high multiplicities of infection. Manipulating expression levels with the multiplicity of infection is difficult since there is inherent competition between the baculoviruses. This is believed to be the reason why offsetting the ratio of BacRep to BacCap always led to lower production of AAV vectors. Furthermore, the highest AAV production was achieved when all three baculoviruses infected the cell at relatively the same time, otherwise a significant reduction occurred. To minimize the amount of total baculovirus added to the system, BacITR, which only supplies the AAV vector genome, could be added at lower multiplicities of infection without significantly affecting the production of AAV vectors.

It was also found that using high MOIS of BacRep may be problematic in the long Instabilities with this baculovirus construct that are atypical of passaging other recombinant baculoviruses resulted in a significant decrease in expression levels over fewer passages. It has been speculated that the instability ensues from the palindromic sequence resulting from the head-to-head orientation of the Rep genes (Kohlbrenner et al., 2005a). The use of low passage BacRep minimizes this effect. An alternate four-baculovirus system developed by Kohlbrenner et al. (2005a) increases the stability by separating the two Rep genes into two baculoviruses. Unlike the triple infection system, it was found, in this work, that capsids are likely the limiting factor when using the quadruple infection system.

The total number of capsids produced always significantly exceeded the number of functional AAV vectors and vector genomes. This implied that there was a potential to increase the efficiency of genome encapsidation. To try and address this limitation using culture parameters, the temperature of the process was modulated. Increasing the temperature during the production phase of the process from 27°C to 30°C increased replication proteins early in the culture, which is thought to be a key reason for the observed increase in SS progeny DNA, ~ two-fold increase in DNAse resistant particles and ~ three-fold increase in functional vectors produced. The most significant replication protein increase was Rep78, which may suggest that the attenuated expression of the Rep78, designed because of its detrimental effects in mammalian cells, may be over-attenuated in the insect cell system.

To fully exploit the insect cell system, the maximum density at which AAV could be produced was investigated. Without adding nutrients during the culture, the synthesis per cell significantly decreased beyond 4x10⁶ cells/ml. Medium renewal at the time of infection allowed production at ~ 1x10⁷ cells/ml although the synthesis per cell was only a fraction of the maximum achieved at lower cell densities. Supplementing the media using a nutrient cocktail increased the specific production but did not achieve the maximum level seen at lower cell densities. Resuspending cells from the early exponential phase, in fresh media, to higher cell densities, maintained specific production levels up to ~ 1x10⁷ cells/ml. Cell "age" therefore played a role in achieving the highest production levels. The strategies developed in this work yield ~6.5x10¹² functional AAV particles/L of cell culture.

L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime que plus d'un million de personnes souffrent de maladies monogéniques. Pour combattre les effets de ces maladies, la protéine codée par le gène déficient doit être administrée de façon routinière ou bien le gène déficient doit être corrigé pour que la protéine soit produite par la cellule.

Pour corriger les gènes déficients, des véhicules permettant de livrer l'information génétique au sein des cellules cibles sont requis. Un moyen efficace de livrer cette information repose sur l'utilisation de vecteurs viraux. La thérapie génique est un secteur important dont l'essor a été considérablement ralenti à cause d'accidents survenus durant les programmes d'évaluation clinique. Deux événements ont en particulier marqué l'histoire de la thérapie génique. Le premier était la mort de Jesse Gelsinger, qui était directement liée à l'administration d'un vecteur adénovirus. Le deuxième incident s'est manifesté comme effet secondaire des traitements utilisant des vecteurs rétroviraux:​ deux enfants qui participaient à un essai clinique visant à traiter la maladie du déficit immunitaire combiné sévère lié au chromosome X, ont développé une forme de leucémie.

Malgré ces échecs, les résultats expérimentaux continuent à démontrer un avenir prometteur pour les vecteurs viraux, et la Chine a récemment autorisé la première commercialisation d'un vecteur viral comme agent thérapeutique. Les vecteurs dérivés du virus adéno-associé (AAV) sont reconnus comme étant très prometteurs avec plusieurs essais cliniques en cours. Entre autres, des essais cliniques en Phase I ont été initiés récemment pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne;​ des succès en Phase I pour le traitement de la maladie de Parkinson nécessite la poursuite d'essais cliniques en Phase II;​ et des essais cliniques en Phase III existent pour le traitement du cancer de la prostate.

Ce petit virus (20 à 26 nm) possède un génome à ADN linéaire simple-brin qui comprend deux cadres ouverts de lecture, pour les gènes des protéines de réplication (Rep) et le gène des protéines structurales (Cap), entre deux séquences palindromiques inversées identiques (ITR). Les gènes des protéines de réplication codent pour quatre protéines:​ Rep78, Rep68, Rep 52 et Rep40. Le gène des protéines structurales (Cap) code pour trois protéines qui forment la capside virale:​ VP1, VP2 et VP3. Les ITRS sont les seules composantes génomiques qui doivent être fournis en cis. Ceci veut dire que les deux cadres ouverts de lecture peuvent être remplacés par un transgène d'intérêt pour créer un vecteur viral. Considéré non-pathogénique, ce petit vecteur ne cause pas de réponses immunitaires significatives une fois administré.

Le AAV est un virus qui se réplique seulement en présence de virus assistants comme l'adénovirus ou l'herpès, sinon il s'intègre dans le chromosome de la cellule hôte pour persister sous forme d'infection latente. Les méthodes traditionnelles de production se servaient de la transfection de cellules mammifères adhérentes par des plasmides qui contenaient les séquences Rep et Cap, et le génome du vecteur AAV, suivi par une infection d'adénovirus. Des avancées dans le domaine ont pu éliminer l'utilisation d'un adénovirus de type sauvage en le remplaçant par seulement quelques séquences adénovirales qui pouvaient être livrées par transfection. Malgré des succès avec les AAV produits par la transfection, cette méthode reste limitée par l'efficacité de la transfection à grande échelle. Avec le but de trouver des moyens plus adéquats pour la mise à l'échelle, de nombreux groupes ont travaillé pour créer des lignées stables, mais l'établissement de ces lignées s'avère difficile.

La production de vecteurs AAV dans les cellules d'insecte a le potentiel de produire assez de matériel pour répondre au besoin des cliniciens. Les cellules d'insecte, contrairement à la culture de cellule mammifère, sont libres de pathogènes humains, n'exigent pas l'usage de sérum animal et sont facilement cultivées en suspension. De plus, la preuve a largement été faite que la technologie utilisant les cellules d'insecte était une plate-forme utilisable à grande échelle. Les cellules d'insecte ont été considérablement exploitées, en conjonction avec le système de vecteur d'expression baculovirus (BEV), pour la production transitoire de protéines recombinantes. Dans ce système, un virus recombinant d'insecte est "fabriqué" pour coder une ou plusieurs protéines d'intérêt. Ce vecteur est alors utilisé pour livrer le ou les gènes étrangers à des cellules dans lesquelles le niveau de production de ces protéines recombinantes peut atteindre jusqu'à 50% des protéines cellulaires totales. En fait, le système BEV a été exploité avec succès pour la production d'une vaste gamme de produits à hautes valeurs commerciales, incluant la production de vaccins, et les vecteurs AAV (Urabe et al., 2002;​ Meghrous et al., 2005).

De nombreux travaux ont été réalisés pour étudier la configuration de bioréacteurs et l'optimisation des paramètres fondamentaux des cultures de cellules d'insecte, mais en terme de dynamique de procédé, le système BEV est un des systèmes les moins étudiés. Les stratégies pour augmenter les concentrations de cellules viables et la production de protéines exigent l'optimisation de la livraison de virus, les niveaux de nutriments ainsi que le temps de récolte du produit.

Le travail présenté dans cette thèse est centré sur la caractérisation de la production du vecteur AAV dans les cellules d'insecte avec le système BEV. Pour la production, les gènes pour les protéines de réplication AAV et les protéines structurales AAV ont été mis sous le contrôle de promoteurs de gènes d'insecte et clonés dans des vecteurs baculovirus (Urabe et al., 2002). Plus précisément, le gène pour la protéine Rep52, sous le contrôle du promoteur de la polyhedrine et le gène pour la protéine Rep78, sous le contrôle d'un promoteur tronqué IE1, sont contenus dans un premier baculovirus, BacRep. Le gène pour les protéines structurales, sous le contrôle du promoteur de la polyhédrine, est contenu dans un deuxième baculovirus, BacCap. Le transgène encadré des ITR AAV est contenu dans un troisième baculovirus, BacITR.

Le but ultime de cette recherche était de comprendre comment atteindre des rendements de produit plus élevés non seulement en terme de productions spécifique (par cellule) mais aussi en terme volumétrique (par unité de volume de culture). Pour caractériser ce système, la synthèse des protéines de réplication, les protéines structurales, les capsides formées, les génomes encapsidés et les particules actives, qui ont la capacité de transduire des cellules mammifères, ont été examinées.

L'importance de la multiplicité d'infection (MOI) dans les systèmes BEV a été démontrée à plusieurs reprises. La MOI, simplement dit, est le ratio entre le nombre de virus et le nombre de cellule lorsque le virus est ajouté à la culture. Quand la MOI totale est haute (>> 1), elle provoque une infection synchrone, où la population complète devient infectée et les cellules cessent de croître. Quand la MOI totale est basse (<< 1), elle provoque une infection non-synchrone, ce qui crée des populations de cellules infectées et non-infectées. Meghrous et al. (2005) ont exploré des stratégies non-synchrones sans succès pour la production de AAV par tri-infection. Dans cette thèse, pour mieux saisir les phénomènes d'interaction entre les protéines et les virus, des conditions provocant des infections synchrones sont utilisées. Avec le système tri-infection utilisé, la MOI de chaque type de virus peut être optimisée. Pour explorer comment la MOI de chaque virus et le ratio entre ces derniers peuvent influencer la production du AAV, des plans expérimentaux factoriels ont été conçus pour des infections de cultures à 2x10₆ cellules/ml. Pour s'assurer que chaque cellule était atteinte des trois baculovirus, la quantité minimale pour chacun des trois virus pouvait elle-même causer une infection synchrone si utilisée seule. La quantité maximale a été établie par des contraintes pratiques, dont le volume de solution virale qui devait être ajoutée à la culture. Un titre maximal de particules actives est obtenu quand un équilibre existe entre les quantités de baculovirus codant pour les protéines AAV. De plus, le titre augmente avec une augmentation de ces deux virus jusqu'à un point de saturation. Le baculovirus contenant le génome du vecteur AAV n'influence pas le titre d'une manière appréciable s'il est présent dans la cellule.

Comme on peut optimiser la quantité de chaque baculovirus ajouté à la culture, le moment de l'ajout peut aussi être optimisé. En gardant l'idée originale d'une infection synchrone à 2x10⁶ cellules/ml, des stratégies de délai d'addition ont été explorées. L'importance de l'ajout du BacRep dès le début de l'infection est ressorti comme indication principale. Un délai de 12 h a contribué à la diminution du titre du vecteur AAV par trois ordres de grandeurs. Tout comme l'étude sur la MOI, l'effet du délai de l'ajout du BacITR était le moins prononcé.

Le système BEV est un système lytique pour les cellules. Cependant avec la production des vecteurs AAV, les quantités de capsides AAV ont pu être corrélées à la viabilité de la cellule. Or, la surproduction de capsides a un effet néfaste sur la cellule. Plus il y a de capsides, plus la viabilité est basse. De plus, quand la viabilité reste élevé, il y a une augmentation dans le titre du AAV si le temps de récolte est décalé. Cependant, les titres maximaux sont généralement accompagnés d'une perte de viabilité.

L'équilibre est délicat. Le nombre de capsides doit être élevé mais ceci doit être accompagné de niveaux élevés de protéines de réplication car il existe aussi une corrélation entre les niveaux de Rep52 et la production de vecteurs AAV actifs. De plus, le BacRep bigénique, qui comprend les gènes pour le Rep78 et le Rep52, s'est avéré instable. Ces instabilités se sont manifestées aux cours de quelques passages de virus en forme de réduction dans les niveaux d'expression. Cette perte d'expression est probablement due à une recombinaison homologue entre les deux gènes qui sont placés tête-à-tête produisant une séquence pratiquement palindromique. Aux cours des passages, la population de virus perd son uniformité et devient très hétérogène. Cependant, la minimisation du nombre de passages réduit cet effet. Il est estimé que suffisamment de vecteur AAV peut être produit pour de grands essais cliniques avec l'utilisation de baculovirus amplifié jusqu'au deuxième passage, cependant ceci reste une limitation du système par tri-infection.

Une autre solution potentielle est l'utilisation de deux BacRep monogénique qui codent pour chacune des deux protéines de réplication:​ BacRep52 et BacRep78 (Kohlbrenner et al., 2005a). En utilisant les mêmes stratégies que pour le système tri-infection, qui démontrait un besoin d'un certain équilibre entre les quantités de baculovirus codant pour les protéines AAV (et non pour le génome du vecteur), les deux BacRep monogéniques ont été ajoutés à des concentrations équivalentes à celui du BacCap. Ceci n'a pas donné d'aussi bons résultats que le système tri-infection. Quand la MOI totale a été abaissée en réduisant la MOI des BacRep de moitié pour que la MOI totale de la quadruple infection soit pareille à celui de la tri-infection, une amélioration du titre AAV a été observée sans toute fois atteindre les mêmes niveaux que pour la tri-infection. Une différence majeure observée entre les deux systèmes était liée au niveau de capsides produites. Avec la quadruple infection, les niveaux étaient plus faibles. Quand une combinaison du BacRep bigénique et un des deux BacRep monogéniques a été utilisée, que ce soit le BacRep52 ou le BacRep78, le titre du AAV produit est resté inchangé. Ces observations mènent à la conclusion que les capsides sont la composante limitante dans le système de quadruple infection.

Même s'il y a besoin de sur-exprimer les capsides pour obtenir des titres optimaux de AAV, il existe une marge de manoeuvre pour optimiser l'encapsidation (le processus d'insertion du génome viral dans la capside). L'écart entre le nombre de particule virale et le nombre de vecteur actif est de plusieurs ordres de grandeurs. Pour diminuer cet écart, il a été postulé que les conditions environnementales, dont la température de la culture, pouvaient jouer un rôle. L'hypothèse première était qu'en abaissant la température, la production de protéines structurales ralentirait, ce qui donnerait plus de temps pour le processus d'encapsidation. Pour essayer d'isoler l'effet de la température sur la production de protéines (et non sur l'absorption du baculovirus et l'acheminement au noyau), le moment du changement de température a été considéré comme un deuxième facteur essentiel. Cette étude, avec le système tri-infection, a en effet permis d'augmenter le degré d'encapsidation, non à cause d'une baisse de température mais à cause d'une hausse de température. Le titre de vecteurs AAV actifs a augmenté avec une hausse de 27°C à 30°C mais a diminué si la température était augmentée à 33°C. De plus, les meilleurs résultats des cultures qui ont subit une diminution de température, n'ont jamais atteint les niveaux de production à 30°C même en retardant la récolte jusqu'à 120 hpi. Le meilleur moment pour changer la température était entre -24 hpi jusqu'à 6 hpi. Une augmentation de la température à 30°C au-delà de 6 hpi, augmente le titre AAV actif mais pas autant que si la température était augmentée auparavant. La production à 30°C entraîne des niveaux de Rep78 supérieures aux productions à 24°C ou 27°C, et l'expression du Rep52 est observée plus tôt. Quoiqu'il y ait une augmentation en protéines de réplication, le nombre total de particules virales ne change pas significativement, ce qui rend l'écart entre les particules AAV totales et les particules actives plus petit.

La production spécifique a été optimisée par rapport à la MOI et à la température de la culture, à une densité cellulaire de 2x10⁶ cellules/ml. Pour prendre avantage du potentiel qu'offre la culture de cellules d'insecte, la production de vecteurs AAV à des densités cellulaires plus élevées a été étudiée en vu d'optimiser la production volumétrique. Meghrous et al. (2005) ont démontré des limitations avec la production de AAV à 27°C (et une récolte à 72 hpi) à des densités cellulaires supérieures à 1-2x10⁶ cellules/ml. Le milieu de culture par contre, devrait être assez riche en nutriments pour maintenir la production spécifique jusqu'à 3-4x10⁶ cellules/ml. Des recherches subséquentes par Chahal et al. (2007) ont indiqué des problématiques de récupération ou de sous-estimation de titre viral causées par un effet relié à la densité cellulaire. Pour éliminer ces effets, les culots cellulaires ont été resuspendus dans un tampon, enrichi de sel, à une densité cellulaire de l'ordre de 7-8x10⁶ cellules/ml.

La production spécifique commence à baisser au-delà de 2x10⁶ cellules/ml mais des niveaux acceptables sont maintenus jusqu'à 3-4x10⁶ cellules/ml, ce qui est plus en accord avec la littérature. À haute densité cellulaire, sans ajout de nutriments ou de renouvellement de milieu, le milieu devient épuisé en sérine ce qui semble entraîner une perte totale (détectable) de production de vecteurs AAV. En renouvelant le milieu au temps d'infection, une partie de la production est récupérée, mais le milieu devient maintenant épuisé en cystine. Un cocktail riche en nutriments conçu pour la production à haute densité (Bédard et al., 1994, 1997) a été utilisé pour éviter l'épuisement du milieu. Même avec l'enrichissement du milieu, la production spécifique a diminué. Pour vérifier si "l'âge" de la cellule pouvait jouer un rôle dans la diminution de la production spécifique, des cellules du début de la phase exponentielle, où les titres maximaux ont été réalisés auparavant, ont été concentrées à différentes densités cellulaires. Cette stratégie a permis de maintenir la production spécifique jusqu'à 1x10⁷ cellules/ml. Au delà de cette concentration cellulaire, le milieu devient épuisé de cystine, tout comme les expériences avec le renouvellement de milieu.

Les protéines de réplications sont essentielles à la formation des vecteurs AAV actifs. Les douze premières heures après l'infection sont critiques. Si un des trois virus est manquant, le titre est affaibli. De plus, c'est dans ces douze premières heures où l'effet de la température est le plus haut, probablement dû à une augmentation de protéines de réplication et un enchaînement plus rapide d'événements viraux. L'instabilité du BacRep complique la mise à l'échelle du procédé tri-infection, mais les effets de l'instabilité de ce baculovirus peuvent être minimisés en purifiant par plaque et en minimisant le nombre de passages utilisés durant l'amplification du virus. L'utilisation de constructions baculovirales plus stables, incluant celles utilisées dans le système avec quadruple infection, seront nécessaires si plus de 10¹⁵ vecteurs AAV actifs sont requis. Cependant l'optimisation future de ce dernier devra adresser la production "sous-optimale” de capsides. Avec la tri-infection, la production à haute densité (1x10⁷ cellules/ml) est possible. Il faudra pousser plus loin. l'analyse des besoins nutritionnels post-infection pour produire à des densités encore plus élevées. De plus, des stratégies de production en mode de perfusion pourraient s'avérer utiles dans ce cas.