Acute myeloid leukemia (AML) is characterized by the accumulation of a large number of abnormal, immature blast cells. Recently, histone deacetylase inhibitors (HDIs), which regulate transcription through modification of chromatin structure, received considerable interest on the ground of their ability to overcome the differentiation block in these leukemic blasts regardless of the primary genetic alteration, an effect achieved either alone or in combination with differentiating agents, such as all-trans retinoic acid (t-RA).

Valproic acid (VPA), a potent HDI, is now under clinical evaluation owing to its potent differentiation effect on transformed hematopoietic progenitor cells and leukemic blasts from AML patients. Conversely, in a clinical study by Bug et al., the favorable effects of the combination treatment with t-RA/VPA in advanced acute myeloid leukemia patients were reported to be most likely due to an enhancement of nonleukemic myelopoiesis and the suppression of malignant hematopoiesis rather than enforced differentiation of the leukemic cells. Moreover, there is evidence that the wide-open chromatin structure required for HSCs multipotentiality and the lineage potential is hierarchically controlled during early hematopoiesis most likely through the control of chromatin modeling program. Consistent with this hypothesis, VPA has been reported to enhance early acting cytokine effect on the maintenance and expansion of primitive normal human HSCs at least in vitro. Hence, the effect of chromatin modeling by VPA on HSCs was investigated with regard to proliferation, differentiation as well as self-renewal in order to evaluate potential for clinical usage of HDIs in acute myeloid leukemia (AML) therapy.

According to the data observed in the present study, VPA increases both proliferation and self-renewal of HSCs as shown by immunophenotypical features, both in vivo and in vitro functional HSC characteristics as well as cell cycle and gene expression analyses.

It is clearly indicated that VPA enhanced the stem cell phenotype and/or increased the number of human HSCs isolated from both adult bone marrow (BM) and umbilical cord blood (CB) rather than differentiated cells either in the presence of early acting cytokines or an external milienu favoring differentation.

Furthermore, VPA enhances proliferation and self-renewal of murine HSCs as demonstrated by the increase in CFU, the percentage of stem cell marker-expressing cells as well as the replating efficiency of cultured murine HSCs with constant CFU in vitro. The enhancing effect of VPA on the replating efficiency of HSCs due to their self-renewal was also confirmed in vivo by an increase in the colony forming unit spleen on day 12 (CFU-S D12) and competitive repopulation efficiency of VPA-treated HSCs.

Based on the cell cycle analysis, valproic acid accelerates murine HSC cell cycle progression from G1 phase to S phase as indicated by the increase in the percentage of cells in S phase and the concomitant decrease in those in G1 phase. In addition, this process is accompanied by a down-regulation of p21^cip-1/waf-1 as demonstrated in both human and murine HSCs.

On the molecular level, VPA inhibits GSK3ß by phosphorylation on Ser9 accompanied by an activation of the Wnt signaling pathway in HSCs. Moreover, HoxB4, a transcription factor as well as a target gene of Wnt signaling, is up-regulated upon exposure to VPA in human and murine HScs. Both, the Wnt signaling pathway and HoxB4 are known to directly stimulate the proliferation of HSC and to expand the HSC pool.

To sum up, valproic acid, a potent histone deacetylase inhibitor known to induce differentiation and/or apoptosis in leukemic blasts, stimulates the proliferation and self-renewal of hematopoietic stem cells. Therefore, the data reported in this study suggest to reconsider the role of histone deacetylase inhibitors from a desired differentiation inducer to a coadjuvant factor for increasing the response to conventional therapy in acute myeloid leukemia.

Akute myeloische Leukämie (AML) ist gekennzeichnet durch die Akkumulation einer großen Zahl abnormaler Zellen, die nicht in funktionelle Granulozyten oder Monozyten differenzieren können. Die überwiegende Mehrheit der AML-Patienten ist über 60 Jahre alt. Standardtherapie ist eine dosisintensive Chemotherapie mit dem Ziel einer kompletten Remission, gefolgt von unterschiedlichen Formen einer Postremissionstherapie. Ein kleiner Teil der Patienten kann mit diesem Therapieansatz geheilt werden. Die meisten Patienten sterben jedoch innerhalb der ersten 2 Jahre aufgrund einer refraktären oder rezidivierten Erkrankung oder an Therapiefolgen.

Verschiedene genetische Änderungen resultieren in einem gemeinsamen Muster deregulierter Genexpression, welches zu einem Differenzierungsblock führt, der die myeloide Leukämogenese fördert. Zusätzlich zur Induktion des leukämischen Phänotyps zeigen sich bei AML aberrante Chromatinremodellierung und Interaktionen von AML-Fusionsproteinen mit Corepressor/Histon-Deacetylase-Komplexen. Man nimmt an, dass Histon-Deacetylasen (HDACs) durch Erniedrigung des Acetylierungslevels der core-Histone unter anderem auch Gene reprimieren, die eine Rolle in Differenzierung und Zellzykluskontrolle spielen. Die starke Toxizität und die limitierte Effizienz heutiger chemotherapeutischer Strategien, sowie die der AML zugrunde liegenden biologischen Mechanismen, haben zur Entwicklung alternativer Therapieansätze geführt, wie z.B. der Differenzierungs-induzierenden Therapie mit Histon-Deacetylase-Inhibitoren (HDIs). HDIs sind Substanzen, die die Hyperacetylierung von core-Histonen induzieren können und somit zur Verringerung des ChromatinKondensationsgrades führen. Dies wiederum erhöht die Zugänglichkeit der DNA für Transkriptionsfaktoren und aktiviert somit Genexpression. Es ist gezeigt worden, dass HDIs wie z.B. Trichostatin A (TSA) oder Valproinsäure (VPA) entweder alleine oder in Kombination mit Differenzierungs-induzierenden Agenzien wie all-trans-Retinsäure (t-RA), den Differenzierungsblock in leukämischen Blasten unabhängig von der primären genetischen Veränderung überwinden können.

VPA (2-Propyl-Pentansäure) ist eine kurzkettige, verzweigte Fettsäure mit günstigen pharmakokinetischen Eigenschaften, welche schon seit Jahrzehnten in der Behandlung von Epilepsien eingesetzt wird. Neuere Untersuchungen zeigten, dass Valproinsäure neben ihrer seit langem genutzten Wirkung auch einen Einfluss auf das Epigenom haben kann, indem sie Histonacetylierung und DNA-Methylierung induziert. Darüber hinaus befindet sich VPA aufgrund seiner potenten Differenzierungseffekte auf Karzinomzellen, transformierte hämatopoetische Vorläuferzellen und leukämische Blasten von AML-Patienten in der klinischen Erprobung.

Auf der anderen Seite wurde in einer klinischen Studie allerdings gezeigt, dass eine VPA/tRA-Kombinationstherapie bei AML-Patienten in fortgeschrittenen Stadien zu einer erheblichen Reduktion der Zahl an Blasten und einer peripheren Hypergranulozytose führt. Überdies war es in einem Patienten möglich normale und maligne Hämatopoese anhand des Vorkommens des Isochromosoms (17)(q10) in den leukämischen Blasten zu unterscheiden. Während CD34-positive Progenitorzellen zu einem geringen Teil noch dieses Isochromosom enthielten, hatten reife Granulozyten einen normalen Karyotyp, was nahe legt, dass es nicht zur forcierten Differenzierung kommt, sondern dass die normale Hämatopoese dominant gegenüber dem malignen Zellklon ist.

Außerdem wird zur Zeit gemutmaßt, dass eine offene Chromatinstruktur essentiell für die Multipotenz hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) ist und das Differenzierungspotential während der frühen Hämatopoese hierarchisch kontrolliert wird, sehr wahrscheinlich über Chromatinmodellierung. In Einklang mit dieser Hypothese führte eine Kombination des Hydroxamsäure-basierten Histon-Deacetylase-Inhibitors Trichostatin A mit DNAdemethylierenden Agenzien zu einer signifikanten Expansion hämatopoetischer Stammzellen, welche zur Repopulation immundefizienter Mäuse in der Lage waren. Zudem konnte gezeigt werden, dass Valproinsäure frühe Zytokin-Effekte auf den Erhalt und die Expansion primitiver menschlicher HSCs zumindest in vitro verstärken kann. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit der Effekt von Valproinsäure-induzierter Chromatinmodellierung auf das Schicksal hämatopoetischer Stammzellen untersucht, um damit die Möglichkeiten des Einsatzes von Histon-Deacetylase-Inhibitoren in der AML-Therapie zu evaluieren.

Zur Bestimmung der Effekte von Valproinsäure auf menschliche hämatopoetische Stammzellen in der Gegenwart sehr früh agierender Zytokine sowie in einem externen, Differenzierung favorisierenden Milieu, wurden die Proliferation und das Differenzierungspotential menschlicher HSCs aus adultem Knochenmark und von Nabelschnurblutzellen, welche einen höheren Prozentsatz an frühen HSCs enthalten, analysiert. VPA verstärkte den Stammzell-Phänotyp und erhöhte nicht die Zahl an differenzierten Zellen, sondern die der Stammzellen, sowohl in den Knochenmarks- als auch in den Nabelschnurblutzellen.

Für einen Vergleich der Effekte von Valproinsäure mit dem bekannten Verstärkereffekt von all-trans-Retinsäure (t-RA) auf das Potential von Maus-HSCs zur Koloniebildung wurden die Untersuchungen auf hämatopoetische Stammzellen der Maus ausgedehnt. Dazu wurde der Effekt von VPA auf die Replatierungs-Effizienz muriner HSCs in einem KoloniebildungsVersuch dem von t-RA gegenübergestellt. VPA verstärkte nicht nur die Koloniebildung, gemessen als Kolonie-bildende Einheiten (colony forming units, CFU), sondern auch die Replatierungs-Effizienz bei konstanter CFU, währenddessen t-RA nur letztere beeinflusst. Außerdem kam es bei VPA-behandelten Zellen nicht zur Differenzierung, was sich an dem hohen Prozentsatz an Zellen zeigte, welche Stammzell-Marker exprimierten. Dies deutet auf eine Erhöhung sowohl der Proliferationsrate, als auch der Selbsterneuerung der VPAbehandelten hämatopoetischen Stammzellen hin.

Um herauszufinden, ob der in vitro Effekt von Valproinsäure auf Maus-HSCs auch auf einem erhöhten Selbsterneuerungspotentials beruht, wurde der Einfluss einer VPA-Behandlung auf die Bildung von Milzkolonien am Tag 12 (colony forming units-spleen, CFU-S D12) und auf die kompetitive Repopulation als Indikator für primitive hamätopoetische Stammzellen, die zu einer zumindest vorübergehenden Repopulation eines Wirtstieres in der Lage sind (short term HSCs, ST-HSCs), untersucht. Ähnlich wie t-RA verstärkt VPA die Selbsterneuerung von HSCs, messbar anhand der hohen Zahl von CFU-S D12 und einer Splenomegalie. Zudem erhöhte sich auch die Effizienz in den kompetitiven Repopulationsversuchen, ein Hinweis darauf, dass VPA einen Einfluss auf primitive hamätopoetische Stammzellen hat.

Ergänzend zu den Analysen zur Proliferation und Selbsterneuerung der Maus-HSCs wurde auf zellbiologischer Ebene der Zellzyklus-Status und die Expression des Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitors (cyclin dependent kinase inhibitor, CDKI) p21cip-1/waf-1 in VPA-behandelten HSCs analysiert, um den Einfluss auf die Zellzyklusregulation in der hämatopoetischen Kaskade beurteilen zu können. Von Histon-Deacetylase-Inhibitoren ist bekannt, dass sie einen Zellzyklusarrest durch die Aktivierung von p21cip-1/waf-1 induzieren können, worauf es zur Differenzierung und/oder Apoptose sowohl von leukämischen Blasten, als auch von Tumorzellen kommt. Überdies gibt es Hinweise darauf, dass p21cip-1/waf-1 möglicherweise Stadien-spezifische Funktionen in der frühen Hämatopoese hat. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass Valproinsäure, im Gegensatz zu t-RA, die Zellzyklusprogression muriner HSCs von der G1- in die S-Phase beschleunigt, was sich in einer Erhöhung des Anteils von SPhasen-Zellen bei gleichzeitiger Verringerung des Prozentsatzes von Zellen in der G1-Phase äußerte.

Außerdem führte VPA zu einer Herunterregulation von p21cip-1/waf-1 in menschlichen und murinen hämatopoetischen Stammzellen. Diese Daten deuten auf einen direkten Zusammenhang zwischen dem Differenzierungslevel und der Antwort auf HistonDeacetylase-Inhibitoren hin. So scheinen sehr unreife Zellen mit einer Herunterregulation von p21cip-1/waf-1 und Zellzyklusprogression auf VPA zu reagieren, während es in fortgeschrittenen Differenzierungsstadien zu einer Hochregulation von p21cip-1/waf-1 und Differenzierung oder Apoptose kommt.

Es ist bekannt, dass Wnt-Signale und der Transkriptionsfaktor HOXB4 direkt die Proliferation von hämatopoetischen Stammzellen stimulieren und damit zu einer Expansion des Pools an HSCs führen. Glykogen-Synthase-Kinase 3β (GSK3β) ist ein negativer Regulator des Wnt-Signatransduktionswegs, welcher zu Stabilisierung von β-Catenin und letztendlich zur Selbsterneuerung von HSCs führt. Vor kurzem wurde gezeigt, dass es nach VPA-Behandlung zur Inhibition von GSK3β durch Phosphorylierung an Serin 9 des Proteins kommt. Um die molekularen Mechanismus aufzuklären, durch welche Valproinsäure die Proliferation und Selbsterneuerung von HSCs induzieren, wurde der Effekt von VPA auf die Expression und Modifikation von GSK3β in menschlichen und murinen HSCs, sowie in KG1-Zellen, welche eine frühe Population menschlicher HSCs repräsentieren (~80% CD34⁺/CD38⁻), untersucht. VPA induzierte die Inhibiton von GSK3β durch Phosphorylierung an Serin 9 bei gleichzeitiger Aktivierung des Wnt-Signalweges. Zusätzlich wurde eine quantitative Analyse der Expression des HoxB4-Gens in HSCs aus Mensch und Maus durchgeführt. Zum einen ist HoxB4ein Zielgen des Wnt-Signalweges, zum anderen stellt der von ihm codierte Transkriptionsfaktor ein Schlüsselmolekül in der Regulation von Selbsterneuerung und Proliferation hämatopoetischer Stammzellen dar. Die Genexpressionsanalysen zeigten deutlich, dass die Behandlung mit Valproinsäure einer Erhöhung der HoxB4-RNA Level im Vergleich mit t-RA behandelten und unbehandelten Zellen führt.

Zusammenfassen lässt sich konstatieren, dass der Histon-Deacetylase-Inhibitor Valproinsäure, der für die Induktion von Differenzierung und/oder Apoptose in leukämischen Blasten bekannt war, die Proliferation und Selbsterneuerung hämatopoetischer Stammzellen stimuliert. Diese Effekte lassen sich wahrscheinlich sowohl auf eine Inhibition von GSK3β in HSCs, als auch auf eine transkriptionelle Reprogrammierung dieser Zellen durch Chromatinmodelling zurückführen.

Diese neu beschriebenen Effekte von Valproinsäure auf hämatopoetische Stammzellen könnten wichtige Konsequenzen für die AML-Therapie haben. Der VPA-induzierte Eintritt von ruhenden hämatopoetischen und leukämischen Stammzellen in den Zellzyklus könnte diese empfindlicher gegenüber konventioneller Chemotherapie machen. In der Tat konnte vor kurzem in einer klinischen Studie gezeigt werden, dass Valproinsäure das Ansprechverhalten gegenüber einer Chemotherapie verbessert.

Die in der vorliegenden Arbeit erhobenen Daten weisen darauf hin, dass die Rolle von Histon-Deacetylase-Inhibitoren in der AML-Therapie überdacht werden sollte und sie weniger als Differenzierungs-Induktoren, sondern eher als Coadjuvantien mit dem Potential zur Verbesserung des Ansprechverhaltens auf konventionelle Chemotherapien gesehen werden können.