Since its original development in 2007, the microfluidic paper-based analytical device (μPAD) technology has started to gain worldwide acceptance. The μPADs feature low cost, favorable biocompatibility, ease of operation, and superior portability. These advantages indicate the great potential of μPADs as miniaturized biosensors with different detection mechanisms, including electrochemistry, colorimetry, fluorometry, and chemiluminescence. Various assays such as immunoassays and hybridization-based nucleic acid detection have been demonstrated on μPADs. The measurements are easy to interpret in semi- or quantitative results with certain portable instruments. The μPADs reveal promising possibilities as point-of-care (POC) tools for personal healthcare monitoring and early-state disease diagnosis, especially in resource-limited settings.

In the past decade, the development of μPADs has been focused on performing more powerful analyte detections with ultrasensitive results by introducing innovative sensing mechanisms and smart device designs. In my doctoral research, I first developed an all-in-one electrochemical μPAD (E-μPAD) for multiplexed testing of cardiac biomarkers in real human blood. Then, I designed a novel paper-based microfluidic valve actuated by thermally-responsive shape memory polymers (SMPs), which led to the development of a fully-automated diagnostic μPAD. The platform was engineered into a handheld format, and is customizable to carry out any multi-step assays on a μPAD in an automated manner for POC diagnosis.

In-situ growth of zinc oxide nanowires (ZnO NWs) on the all-in-one E-μPAD was employed to increase the surface-area-to-volume ratio and electron transfer property of the E-μPAD. Compared to conventional carbon working electrodes (WEs) on μPADs, electrochemical signals were enhanced of 550% by introducing ZnO NWs on the WE in cyclic voltammetry measurements. By using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) sensing mechanism, I first completed the calibration of three cardiac biomarkers, including troponin I, brain-natriuretic-peptide (BNP)-32, and D-dimer, in spiked artificial human plasma on the all-in-one E-μPAD. The limits of detection (LODs) were confirmed to be 190 fM, 40 fM, and 730 fM, respectively. Then, I demonstrated the detection of the three cardiac biomarkers in spiked real human blood. The all-in-one μPAD is highly integrated into a compact size and easy to be operated in an origami fashion. It offers ultrasensitive and rapid diagnosis of bloodborne protein markers, promising its significant application to POC testing.

Although the all-in-one μPAD shows the feasibility in clinical uses, its operation requires a certain level of professional skills and manual involvements (e.g., use of a pipette and a potentiostat), which may restrict the scope of its on-site applications, especially for use by nonprofessional operators. In this regard, I spent efforts on developing an automated μPAD platform to realize sample-in-answer-out (SIAO) testing. In the platform, I utilized thermally-responsive SMPs as localized actuators to lift pre-cut paper valves to connect and disconnect paper channels on a single-layer μPAD. By turning on and off copper heaters to activate the SMPs, reagent transferring and washing processes for multi-step assays were completed on the μPAD in a fullyautomated way. The minimum activation times to open and close the paper valves were measured to be 22.7 ± 3.7 s and 24.4 ± 5.3 s, respectively.

I carried out direct ELISA calibration of rabbit IgG in phosphate buffered saline (PBS) with the SIAO platform and achieved a low LOD of 27 pM (comparable to standard paper-based ELISAs under manual operations). I also detected rat tumor-necrosis-factor (TNF)-α in protein extractions from rat laryngeal tissues (i.e., vocal folds) by sandwich ELISA with the platform and the LOD was determined to be 22 pM. Furthermore, I tested pepsin in human laryngeal surface secretions on the platform with a LOD of 5.8 pM. The measurements for rat and human samples were both benchmarked by standard ELISAs. By Bland-Altman analysis, our platform revealed 94.4% agreement (within 95% confidence interval around the mean) to the standard ELISAs. The platform has also been extended to DNA detection. By coating few-layered molybdenum disulfide (MoS2) nanosheets (under five layers) onto a μPAD as quenching substrate, the fluorophore-tagged DNA probes (pre-attached to MoS2 nanosheets) were used to detect the presence of DNA target (complementary to the DNA probe in nucleotide sequences) by quantifying the fluorescence signal change. The DNA hybridization was fulfilled automatically on the platform and achieved a LOD of 610 pM.

In the development of the SIAO platform, I also carried out an experimental study of comparing five popular surface biofunctionalization methods to enhance adsorption of biomolecules (e.g., proteins and nucleic acid probes) on μPADs. Cellulose paper surface can be modified with active sites for covalent immobilizations to reduce or eliminate non-specific bindings and improve signal outputs. I experimentally investigated modification performance of the methods by carrying out standard paper-based direct ELISAs. The method with potassium periodate (KIO4) was observed with 59% decreased background noise and 53% increased colorimetric signal outputs, and then chose to chemically modify μPADs in the automated platform works.

My doctoral research made original contributions to the field not only on new μPAD designs for electrochemical sensing and fully-automated device operation, but also on the demonstration of practical uses of the developed devices for testing rat and human samples. This work provides promising and reliable POC tools for use by unskilled professionals and end users to monitor patient health status and conduct early-state disease diagnosis.

Depuis son développement initial dans la 2007, la technologie du dispositif analytique à base de papier microfluidique (μPAD) a commencé à être acceptée dans le monde entier. Les μPADs sont les caractéristiques d'un faible coût de fabrication, une bonne biocompatibilité, une bonne portabilité, etc. Ces avantages indiquent que les μPADs a un grand potentiel en tant que biocapteur miniature et sensible avec différents mécanismes de détection, (y compris l'électrochimie, la colorimétrie, la fluorométrie et la chimiluminescence). Divers tests, tels que l'immunodosage et l'hybridation d'ADN, ont été montrés sur μPADs. Les mesures sont faciles à interpréter dans la moitié de résultats ou les résultats quantitatifs avec certains instruments portatifs. Les μPADs révèlent de bonnes possibilités en tant qu'outils de point de soins (POC) pour les utilisateurs finaux sur la surveillance des soins de santé personnels et le diagnostic des maladies à l'état précoce, en particulier dans les environnements à ressources limitées.

Au cours de la dernière décennie, les μPADs se sont concentrés sur l'exécution de tests plus complexes avec des résultats ultra-sensibles en introduisant des mécanismes de détection innovants et des conceptions de dispositifs intelligents. Dans ma recherche de doctorat, j'ai d'abord développé un tout-en-un μPAD pour tester les biomarqueurs cardiaques dans le sang humain réel. Ensuite, j'ai conçu un nouveau type de valve microfluidique à base de papier actilée par la réponse thermique de la forme polymère de mémoire (SMPs), pour réaliser le diagnostic automatique de μPADs. La plate-forme est conçue comme un format de poche qui peut être personnalisé et peut être automatisé toute détection multi-étape sur μPAD pour réaliser les diagnostics POC.

La croissance in situ des nanofils d'oxyde de zinc (ZnO NWs) sur le μPAD tout-en-un est employée pour améliorer le rapport entre la surface micro-superficielle et le volume et la performance du transfert d'électrons de μPAD. Comparé aux électrodes conventionnelles de travail du carbone (WEs) sur μpads, les signaux électrochimiques ont été amplifiés par 5,5 fois en introduisant des ZnO NWs sur WE de voltampmétrie cyclique. En utilisant le mécanisme de détection de la spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS), j'ai d'abord effectué l trois biomarqueurs cardiaques dans le plasma sanguin artificiel dopé sur le tout-en-un μPADs, y compris la troponine I, les peptides cérébraux naturels (BNP)-32 et d-deux agrégats. La limite des détections (LODs) a été confirmée à 190 fM, 40fM et 730 fM, respectivement. Puis j'ai démontré les détections des trois biomarqueurs cardiaques dans le sang humain réel dopé. Le tout-en-un μPAD est fortement intégré dans une taille compacte et facile à être utilisé dans une mode origami. Il offre un diagnostic ultrasensible et rapide des marqueurs protéiques transmissibles par le sang, montrant son application significative aux tests de POC. Bien que le tout-en-un μPAD étende sa faisabilité dans les cliniques, ses opérations exigent un certain niveau de compétence professionnelles les implications manuelles (par exemple l’utilisation d’une pipette et d’un potentiostat), ce qui peut restreindre la possibilité de sea applications sur le site, en particulier pour les utilisateurs finaux non professionnels. J'ai ensuite passé des efforts pour développer une plateforme automatisée sur les μPADs pour implémenter les tests de rappel de l'échantillon (SIAO). Dans la plate-forme, j'ai utilisé des SMPs thermosensibles comme actionneurs localisés pour soulever des vannes de papier pré-coupées pour connecter et déconnecter les canaux de papier Isconnect sur le μPAD. En contrôlant l'ouverture et la fermeture des radiateurs en cuivre pour activer les SMPs, les processus de transfert et de lavage des réactifs pour les essais en plusieurs étapes ont été complétés sur le μPAD de façon entièrement automatisée. Les durées minimales d'activation pour ouvrir et fermer les vannes de papier ont été mesurées à 22,7 ± 3,7 s et 24,4 ± 5,3 s respectivement.

J'ai effectuél'étalonnage ELISA direct de l'IgG de lapin dans le tampon de phosphate de saumure (PBS) avec la plate-forme SIAO et atteindu une faible LOD du pM (comparé aux ELISAs standard à base de papier dans le cadre d'opérations manuelles). J'ai aussi détecté la tumeur de ratnécrose-facteur (TNF)-α des extractions de protéine du tissu laryngé de rat (c’est-à-dire, plis vocaux) par Sandwich ELISA avec la plate-forme et le LOD qui est déterminé à 22 pM. En outre, j'ai testé la pepsine dans les sécrétions de surface laryngée sur la plate-forme avec un LOD de 5,8 pM. Les mesures pour les rats et les échantillons ont été évaluées à la fois par des ELISAs standard. Par l'analyse de Bland-Altman, nous avons révélé 94,4% d'accord (dans un intervalle de confiance de 95% autour de la moyenne) à la St. Andard ELISAs. La plate-forme a aussi été étendue à la détection d'ADN. En enduisant du nanomètre de disulfure de molybdène monocouche (MoS2) (sous cinq couches) sur le μPAD comme substrat de trempe, les sondes d'ADN marquées par le fluorophore (pré-attachées aux nanomètres de MoS2) ont été utilisées pour détecter la présence de la cible d'ADN (complémentaire à la sonde d'ADN dans les séquences de nucléotides) en quantifiant le changement de signal de fluorescence. L'hybridation de l'ADN a été réalisée automatiquement sur la plate-forme et a atteint un LOD de 610 pM.

Dans le développement de la plate-forme SIAO, j'ai aussi réalisé une étude expérimentale de la comparaison de cinq méthodes populaires de biofonctionnalisation de surface pour améliorer l'adsorption des biomolécules (par exemple, les protéines et les sondes d'acide nucléique) sur les μPADs. La surface du papier cellulosique peut être modifiée avec des sites actifs pour les immobilisations covalentes afin de réduire ou d'éliminer les liaisons non spécifiques et d'améliorer les sorties du signal. J'ai étudié expérimentalement les performances de modification des méthodes en effectuant des ELISAs directes à base de papier standard. La méthode avec le periodate de potassium (KIO4) a été observée avec 59% de bruit de fond diminué et 53% d'augmentation des sorties de signal colorimétrique, puis a choisi de modifier chimiquement les μPADs dans les travaux de la plate-forme automatisée.

Ma recherche de doctorat a fait des contributions originales sur le terrain à de nouvelles conceptions de μPAD pour la détection électrochimique et le fonctionnement entièrement automatisé de l'appareil, mais aussi sur la démonstration des utilisations pratiques des dispositifs développés pour tester des échantillons de rats et humains. Ce travail fournit aux utilisateurs finaux des outils de PDP prometteurs et fiables pour surveiller leur état de santé et diagnostiquer les maladies de l'état précoce.