Polymeric hydrogels are cross-linked polymer materials able to absorb very large quantities of water. This characteristic swelling ability makes them strongly resembling the extracellular matrix (ECM) and thus very suitable as biomaterials for the study of material-cell interactions. The understanding of how physical parameters such as substrate stiffness, topography and ligand density impact on the way how cells adhere, spread, proliferate, migrate and differentiate has become of large importance in recent years.

In Chapter 2, a novel, single step method for the production of polyacrylamide hydrogels with a gradient in mechanical properties is presented. In contrast to already existing techniques such as UV photo-polymerization with photomasks or microfluidic gradient mixers, this technique is not suffering from typical limitations, such as limited penetration depth and a complex microfluidic chip, respectively. Young’s modulus of the hydrogels is varied by changing the total monomer concentration of the hydrogel precursor solution. Using programmable syringe pumps, the total monomer concentration in the solution fed to the hydrogel mold is varied from 16 wt% down to 5 wt% over the feeding time to obtain a gradient in compliance ranging from 150 kPa down to 20 kPa over a length of 10 mm down to 2.5 mm. Polymerization is achieved with the dual initiation system composed of ammonium persulfate and N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine, which are both fed through separate capillaries to avoid premature polymerization. Functionalized with the model ligand collagen I, the substrates are bioactive and support the attachment of human foreskin fibroblasts (around 30% of the cells seeded attach after 1 h). A kinetic morphology study on homogeneous hydrogels of different stiffness’s indicates that fibroblasts tend to spread to their final size within 2 h on stiff substrates, while the spreading time is much longer (4 – 5 h) on soft substrates. These trends are confirmed on hydrogels with compliance gradients, showing well spread fibroblasts on the stiff end of the hydrogel after 2 h, while the cells on the soft end still have small area and rounded morphology. Cell durotaxis, the directed movement and relocation of adhering cells towards the stiff end of a material with a mechanical gradient was previously reported for several cell types and stiffness profiles (Lo et al., Biophys. J., 2000, 79, 144). Even though collective cell migration is of critical importance in many processes and has widely been analyzed in the literature, the phenomenon of durotaxis was so far only observed in conditions where cell-cell contacts were rare. In Chapter 3 instead, polyacrylamide hydrogels with long mechanical gradients ranging from 10 to 85 kPa over a distance of 9 mm are used for the assessment of directed migration of human foreskin fibroblasts. We seed the cells at a monolayer density onto the soft region of the substrate only, while covering the gradient and stiff zones during seeding. After 24 hours, attachment and spreading has occurred and the cover is removed, allowing the cells to migrate. After up to 14 days, we observe that the cell monolayer has advanced toward the stiff end at a velocity of 16 μm h-1, while the corresponding value is only 10 μm h-1 on both the homogeneously soft and stiff control samples. This is, to our knowledge, the first experimental study to highlight the accelerating effect of a mechanical gradient at confluent cell densities.

Besides the fact that hydrogels have multiple potential applications in the biomedical field of tissue engineering, they are particularly difficult to characterize experimentally due to their cross-linked network. Often, their characterization is limited to swelling and mechanical measurements, thus providing only partial information on the network structure. To overcome this issue, many modeling approaches have been used to better understand and predict the structure of the hydrogel network. This task is particularly challenging, since many properties of the gel diverge at the gel point. In Chapter 4, a model of free-radical cross-linking copolymerization in solution, based on Flory’s gelation theory and developed by Tobita and Hamielec (Tobita and Hamielec, Macromolecules, 1989, 22, 3098) is applied to the system acrylamide/N,N’-methylenebisacrylamide. The evaluation of missing rate constants is performed by comparing model predictions with experimental measurements of swelling ratios and literature data. This way, the interplay of cross-linking and intramolecular cyclization reactions, regulating the network formation and its properties, is deepened. It turns out that the primary intramolecular cyclization is practically independent of the cross-linker amount employed, but it is affected by the total monomer concentration. For the latter dependency, an empirical correlation is proposed and tested in parametric simulations, showing its impact on the properties of hydrogels.

Another modeling approach is shown in Chapter 5. A simple free-radical polymerization scheme of a monovinyl (difunctional) monomer and a divinyl (tetrafunctional) cross-linker in a Monte Carlo (MC) scheme is implemented, which describes polymer dynamics using a bond-fluctuation model. MC simulations allow us to follow the entire polymerization kinetics and the formation of the percolating network (gel phase) by realistically taking into account diffusion limitations, to extract scaling information at the percolation threshold and to recover the distribution of number of monomer units between two successive fully cross-linked units, from which the extent of swelling can be computed. The predictions of MC simulations are also successfully compared to a kinetic model based on numerical fractionation, with kinetic constants used as fitting parameters. MC data and kinetic simulations are compared to experimental data on the swelling behavior of polyacrylamide hydrogels and of poly(methyl methacrylate) (PMMA) gels, exhibiting good agreement. We conclude that the proposed MC simulation scheme represents a powerful tool from which precious and experimentally inaccessible information on polymerization processes in the presence of cross-linkers can be extracted.

Chapter 6 presents a hydrogel that is already closer to a possible commercial application. It is produced from a large, biocompatible macromonomer based on poly(ethylene glycol) (PEG) as first described by Hubbell et al. (Sawhney et al., Macromolecules, 1993, 26, 581). The alcohol end groups of the linear PEG are modified with defined numbers of lactic acid (LA) units via the ring opening polymerization of d,l-lactide to obtain the PLA-b-PEG-b-PLA block copolymer. Subsequently, a methacrylic group is added to the each end of the macromonomer to make it reactive in a free-radical polymerization process. The large macromonomer was previously reported to be biocompatible and suitable for the 3D encapsulation of several cell types (Chatterjee et al., Biomaterials, 2010, 31, 5051), e.g. through UV photo-polymerization. In a study of polymer degradation at physiological conditions, the resulting polymer hydrogels of different compositions (both in macromonomer and LA content) are extensively characterized in terms of mass loss, compressive modulus and swelling. The purely kinetic degradation model proposed by Metters et al. (Metters et al., Polymer, 2000, 41, 3993;​ Metters et al., J. Chem. Phys. B, 2000, 104, 7043) is not able to predict the mass loss behavior observed in our experiments. This is due to strong diffusion limitations occurring during degradation. Therefore, the kinetic model is refined considering diffusion limitations. We introduce a diffusion term for all species not being linked to the polymethacrylate chains. As for the diffusion coefficients, we estimate them as a function of the hydrogel composition through an empirical quadratic relationship with the gel fraction. The parameters α and β contributing to a reduction of the diffusion coefficient inside the hydrogel network are fitted individually for each hydrogel composition. The reverse gelation, which leads to the complete disintegration of the network structure, is taken into account in the model using a critical weight content of polymer in the hydrogel. Below this threshold, the diffusion of all components is drastically accelerated (w_gel,c = 2 wt%), leading to a rapid increase in mass loss. All other parameters used in the degradation model are extracted from the literature.

Polymer-basierte Hydrogele sind quervernetzte Polymermaterialien, welche grosse Mengen an Wasser absorbieren können. Diese Fähigkeit anzuschwellen bewirkt, dass sie der extrazellulären Matrix sehr ähnlich sind und somit zum Studium von Interaktionen zwischen Zellen und Materialien geeignet sind. Das Verständnis des Einflusses von physikalischen Parametern wie zum Beispiel der Substrathärte, der Substrattopographie oder der Dichte an Bindemolekülen auf die Art und Weise wie Zellen anhaften, sich ausdehnen, proliferieren, migrieren und differenzieren wurde in jüngster Vergangenheit zu einem wichtigen wissenschaftlichen Thema.

In Kapitel 2 dieser Arbeit wird eine neuartige, simple Methode zur Produktion von Polyacrylamid-Hydrogelen mit einem mechanischen Gradienten gezeigt. Im Gegensatz zu bereits existierenden Techniken wie zum Beispiel UV PhotoPolymerisation mit einer Photomaske (beschränkte Eindringungstiefe des UV Lichtes) oder mikrofludische Gradientenmixer (komplexer mikrofluidischer Chip notwendig) leidet die hier vorgestellte Technik nicht unter solchen Nachteilen. Der Young’s Modulus der Hydrogele wird durch Veränderung der totalen Monomerkonzentration der in die Form zugeführten Lösung modifiziert. Mittels programmierbarer Spritzenpumpen wird die totale Monomerkonzentration der zugeführten Lösung während des Füllens von 16 wt% runter auf 5 wt% variert. Es werden somit Hydrogele mit einem mechanischen Gradienten von 150 kPa runter auf 20 kPa über eine Länge von 10 mm bis 2.5 mm produziert. Die Polymerisation wird mit dem dualen Initiationssystem bestehend aus Ammoniumpersulfat und N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin gestartet. Beide Komponenten werden über separate Kapillare zugeführt, um eine vorzeitige Polymerisation zu vermeiden. Die Hydrogele werden mit dem Modellliganden Kollagen I zu bioaktiven Substraten funktionalisiert und unterstützen die Anhaftung von menschlichen Fibroblasten (ungefähr 30% der ausgelegten Zellen sind bereits nach einer Stunde angehaftet). Eine kinetische Studie der Zellmorphologie auf homogenen Hydrogelen mit verschiedenen Härten zeigt, dass die Fibroblasten auf harten Hydrogelen innerhalb von 2 Stunden ihre finale Grösse erreichen, wohingegen die Ausbreitung auf weichen Gelen deutlich länger dauert (4 – 5 Stunden). Dieser Trend wird auf Hydrogelen mit mechanischen Gradienten bestätigt:​ Nach 2 Stunden sind die Fibroblasten am harten Ende des Hydrogels stark ausgebreitet während sie auf dem weichen Ende immer noch eine kleine Oberfläche und eine rundliche Morphologie aufweisen.

Über Zelldurotaxis, die orientierte Bewegung und Relokalisierung von anhaftenden Zellen in Richung des härteren Endes eines Materials mit einem mechanischen Gradienten, wurde in der Vergangenheit für verschiedene Zelltypen und Gradientenprofile berichtet (Lo et al., Biophys. J., 2000, 79, 144). Auch wenn kollektive Zellmigration in zahlreichen Prozessen von kritischer Bedeutung ist und diese bisweilen weitgehend in der Literatur untersucht wurde, wurde über das Phenomen Durotaxis erst in Bedingungen berichtet, in denen Zell-Zell-Kontakte selten sind. Hingegen werden im dritten Kapitel dieser Arbeit Polyacrylamid Hydrogele mit langen mechanischen Gradienten von 10 bis 85 kPa über eine Länge von 9 mm zur Untersuchung der gerichteten Migration von menschlichen Fibroblasten verwendet. Die Zellen werden auf dem weichen Ende des Substrates bei einer Dichte ausgelegt, die die gesamte Oberfläche bedeckt, während das mittlere Stück und das harte Ende des Hydrogels abgedeckt werden. 24 Stunden danach haben die Zellen am Substrat angehaftet und sich ausgebreitet. Folglich wird die Abdeckung entfernt und die Zellen können migrieren. Nach 14 Tagen beobachten wir, dass sich die Zellschicht mit einer Geschwindigkeit von 16 μm h-1 in Richtung der harten Endes bewegt, während der entsprechende Wert 10 μm h-1 auf homogen weichen und harten Substraten beträgt. Dies ist unserer Kenntnis nach die erste experimentelle Studie, welche den beschleunigenden Einfluss eines mechanischen Gradienten bei hohen Zelldichten zeigt.

Obschon Hydrogele vielfache mögliche biomedizinische Anwendungen in der Gewebezüchtung haben, gestaltet sich ihre experimentelle Charakterisierung aufgrund ihrer stark quervernetzten Struktur als äusserst schwierig. Oft limitiert sich die Charakterisierung auf Schwellungs- und mechanische Messungen, wodurch nur partielle Informationen zur Netzstruktur gewonnen werden können. Zahlreiche mathematische Modelle wurden angewandt, um dieses Problem zu überwinden und um die Struktur des Hydrogelnetzwerkes vorauszusagen. Diese Aufgabe ist eine besonders schwierige Herausforderung, da viele Eigenschaften der Gelphase beim Gel-Punkt divergieren. Im vierten Kapitel dieser Arbeit wird ein Modell für die quervernetzende Radikalpolymerization in Lösung, auf der Gelierungstheory von Flory und von Tobita und Hamielec (Tobita and Hamielec, Macromolecules, 1989, 22, 3098) basierend, entwickelt und auf das System Acrylamid/N,N’-Methylenbisacrylamid angewandt. Die Evaluation der fehlenden kinetischen Konstanten wird über den Vergleich von vorhergesagten Modellergebnissen mit experimentellen Schwellungsmessungen und Literaturwerten durchgeführt. Auf diese Art und Weise kann das Wechselspiel zwischen Quervernetzung und intramolekularer Zyklisierung, welche die Netzwerkstruktur und -eigenschaften reguliert, besser verstanden werden. Es stellt sich heraus, dass die primäre intramolekulare Zyklisierung nahezu unabhängig von der Menge an Quervernetzer ist, hingegen aber stark von der gesamten Monomerkonzentration abhängt. Für die letztere Abhängigkeit wird eine empirische Korrelation vorgeschlagen, welche in parametrischen Simulationen getestet wird, um ihren Einfluss auf die Hydrogeleigenschaften zu zeigen.

Ein weiterer Modellansatz wird im fünften Kapitel dieser Arbeit präsentiert. Ein simples Schema von Radikalpolymerization mit einem monovinylen Monomer (bifunktional) und einem divinylen Quervernetzer (tetrafunktional) wird in einem Monte Carlo (MC) Modell implementiert, welches die Polymerdynamik in einem Bindungsfluktuationsmodell beschreibt. MC Simulationen erlauben uns die gesamte Polymerisationskinetik und die Bildung eines Perkolationsnetzwerkes (die Gelphase) realistisch zu folgen, indem Diffusionslimitierungen natürlich betrachtet werden. Es können ebenfalls Skalierungsinformationen bei der Perkolationsgrenze und die Verteilung der Anzahl an Monomereinheiten zwischen zwei aufeinanderfolgenden quervernetzten Einheiten gewonnen werden, aus denen sich der Schwellungszustand errechnen lässt. Die Voraussagungen der MC Simulationen werden auch erfolgreich mit einem auf der numerischen Fraktionierung basierenden kinetischen Modell verglichen, bei dem die kinetischen Konstanten angepasst werden. MC Daten und kinetische Simulationen werden mit einigen experimentellen Schwellungsdaten von Polyacrylamidhydrogelen und Polymethylmethacrylat (PMMA) Gelen verglichen und ergeben eine sehr zufriedenstellende Übereinstimmung. Wir kommen daher zum Schluss, dass das vorgeschlagene MC Simulationsschema ein leistungsfähiges Werkzeug darstellt, welches wertvolle, experimentell nicht messbare Informationen zu Polymerisationsprozessen mit Quervernetzern liefert.

Kapitel 6 präsentiert ein Hydrogel, das bereits deutlich näher an einer möglichen kommerziellen Anwendung dran ist. Das Hydrogel wird aus einem grossen, biokompatiblen, Polyethylenglycol (PEG)-basiertem Makromonomer hergestellt, wie es zuerst von Hubbell und Mitarbeitern beschrieben wurde (Sawhney et al., Macromolecules, 1993, 26, 581). Die Alkoholgruppen am Ende des linearen PEGs werden mittels der Ring-öffnenden Polymerisation von d,l-Lactid mit einer definierten Anzahl Milchsäuregruppen modifiziert um das PLA-b-PEG-b-PLA Blockkopolymer zu erhalten. Anschliessend wird eine Methacrylatgruppe an beiden Enden des Makromonomers angehängt, um es für die Radikalpolymerisation reaktiv zu machen. Dieses grosse Makromonomer wurde bereits als biokompatibel und als geeignet für die 3D Enkapsulierung von verschiedenen Zelltypen bezeichnet (Chatterjee et al., Biomaterials, 2010, 31, 5051), z.B. durch UV Photo-Polymerisation. Im Rahmen einer Degradationsstudie bei physiologischen Bedingungen werden die resultierenden Hydrogele verschiedener Zusammensetzungen (sowohl in Gesamtpolymergehalt als auch Gehalt degradierbarer Einheiten) durch Messung des Gewichtsverlustes, der mechanischen Eigenschaften und der Schwellung umfassend charakterisiert. Das vollständig kinetische Modell von Metters et al. (Metters et al., Polymer, 2000, 41, 3993;​ Metters et al., J. Chem. Phys. B, 2000, 104, 7043) ist nicht in der Lage, den in den Experimenten beobachten Verlauf des Gewichtsverlustes vorherzusagen. Dies ist auf die starke Diffusionslimitierungen im Degradationsprozess zurückzuführen. Aus diesem Grund wird das kinetische Modell in Anbetracht der Diffusionslimitierung verfeinert. Für alle nicht an den Polymethacrylatketten hängenden Spezies wird ein Diffusionsterm eingeführt. Die Diffusionskoeffizienten werden in Abhängigkeit der Hydrogelzusammensetzung über eine empirische quadratische Korrelation mit dem Gelanteil verknüpft. Die Parameter α und β, welche zu einer Verringerung des Diffusionskoeffizienten im Hydrogel führen, werden für jede individuelle Netwerkzusammensetzung gefittet. Die reversible Gelierung, welche zu einer vollständigen Auflösung des Hydrogels führt, wird im Modell mit einem kritischen Polymer Gewichtsgehalt berücksichtigt. Unterhalb dieser Grenze wird die Diffusion aller Komponenten stark beschleunigt, was zu einer schnellen Erhöhung des Gewichts- verlustes führt (w_gel,c = 2 wt%). Alle weiteren Modellparameter werden aus der Literatur bezogen.