Preterm birth is the main cause of mortality for children under 5 years old and is one of the biggest problems in the obstetrics field. One of the causes of preterm birth is the preterm rupture of the fetal membranes (FMs). Preterm rupture of FMs after fetoscopic interventions (iPPROM) occurs in approximately 30% of the cases and is a direct cause of preterm birth, which carries associated physical and neurological consequences for the newborn. The causes for iPPROM have been extensively discussed, and could include the perforation of the FMs and the lack of healing of the defect. Therefore, it is widely accepted that treatments to reestablish FM integrity could prevent iPPROM. Despite intense research, such urgently needed clinically applicable treatments are missing.
In this thesis, towards engineering healing-triggering biomaterials, we set out to build in vitro and in vivo amnion models to test novel healing-promoting biomaterials and to elucidate components of the human amnion that are involved in controlling FM growth and regeneration.
For the development of our in vitro amnion model, we established 3D cultures of amnion-derived mesenchymal cells (hAMCs) in a poly(ethylene glycol) (TG-PEG) hydrogel. The orthogonal design of this biomimetic hydrogel permits the formation of amnion-mimicking microenvironments with tailored biophysical and biochemical properties. We then established a proteomics-based platform to study how hAMC deposit ECM and modify these microenvironments. We showed that platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), an earlier shown hAMC proliferation and migration-inducing factor, could promote the deposition of amnion-related ECM proteins.
To investigate the effect of PDGF-BB to elicit a healing response of FMs, we established a pregnancy model in sheep. In this novel in vivo model, we were able to implant umbrella-shaped implants loaded with the biomaterial. We observed that PDGF-BB promoted angiogenesis and host cell recruitment from the vicinity of the FMs and the myometrium into TG-PEG hydrogels. These findings, together with the herein established model, open the door to future in vivo studies that advance towards understanding FM-healing mechanisms in vivo.
The still fragmentary knowledge on the FM biology is significantly limiting the development of the next generation of biomaterials for FM repair. By a liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LCMS) analysis, we established the most complete human amnion protein composition existing so far. Furthermore, we identified a high number of core ECM and ECM-associated proteins that hold promise for engineering of next generation biomaterials for FM repair.
Since the FMs are dynamic tissues that develop from conception to delivery, the next logic step was the examination of paired amnion samples from 2nd (intervention time) and 3rd (delivery) pregnancy trimesters. Our analysis revealed very different protein signatures between the two pregnancy stages, with midterm tissues having enriched cellular processes, and term tissues having inflammation-related proteins upregulated. This study strongly suggests significant differences in biological functions in midterm and term amnion. Additionally, it might enable the elucidation of regulatory networks that govern the growth and might inhibit healing of defective amnion tissues.
In summary, through in vitro and in vivo amnion models and the characterization of human amnion, this thesis provides a stepping-stone for the development of new FM healing biomaterials. We demonstrate that GF-loaded biomaterials can elicit a FM healing response both in vitro and in vivo. To the best of our knowledge, we provide the currently most comprehensive proteome of term human amnion. Additionally, for the first time the comparison of paired amnion samples from early and term pregnancies sheds light on the physiological maturation of the amnion. We envision that the integration of the collected knowledge here is an inspiration for the engineering of next generation FM-tailored, healing-triggering biomaterials, to ultimately prevent iPPROM and preterm birth.
Frühgeburten sind die häufigste Ursache für die Sterblichkeit von Kindern unter 5 Jahren und eine der größten Komplikationen im Bereich der Geburtshilfe. Ein häufiger Auslöser von Frühgeburten ist das vorzeitige Versagen der Eihäute, auch fetale Membranen (FM) genannt. Ein vorzeitiges, auf den fetoskopischen Eingriff folgendes Versagen der FM (preterm prelabor rupture of fetal membranes, iPPROM) wird in bis zu 30 % der Fälle beobachtet und ist für Frühgeburten verantwortlich. Die Ursachen dafür wurden ausgiebig diskutiert und dürften die Perforation der FM und eine ausbleibende Heilung des Defekts sein. Es wird deshalb im Allgemeinen davon ausgegangen, dass Therapien, welche die Integrität der FM wiederherstellen, iPPROM verhindern könnten. Trotz intensiver Forschung fehlen jedoch solche dringend benötigten klinisch anwendbaren Therapien.
In dieser Dissertation haben wir uns zum Ziel gesetzt, in vitro- und in vivo-Amnionmodelle zu entwickeln, die uns ermöglichen, neuartige heilungsfördernde Biomaterialien zu testen und Komponenten des menschlichen Amnions, die das Wachstums und die Regeneration der FM beeinflussen, aufzuschlüsseln.
Für die Entwicklung unseres in vitro-Amnionmodells etablierten wir 3D-Kulturen, welche aus Poly(ethylenglycol) (TG-PEG) Hydrogel und darin eingebetteten menschlichen Amnionzellen (hAMC, human amnion mesenchymal cells) bestehen. Das orthogonale Design dieses biomimetischen Hydrogels ermöglicht die Nachahmung von Zell-Nischen mit maßgeschneiderten biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften, wie sie im Amnion vorkommen. Um zu untersuchen wie sich diese ZellNischen durch hAMCs verändern, haben wir eine „Proteomics“-basierte Methode entwickelt, die uns ermöglicht die von den Zellen abgelagerte extrazelluläre Matrix (ECM) zu bestimmen. Darin konnten wir zeigen, dass ein hAMC-Proliferations- und Migrations-induzierender Faktor (platelet-derived growth factor-BB; PDGF-BB) die Ablagerung von im Amnion auftretenden ECM-Proteinen fördern könnte.
Um die Wirkung von PDGF-BB freisetzenden TG-PEG-Hydrogelen auf die Heilung von Defekten in FM zu untersuchen, haben wir ein Trächtigkeitsmodell im Schaf entwickelt. In diesem in vivo Modell konnten Biomaterialien mit Hilfe eines schirmähnlichen Implantats auf den FM-Defekt angebracht werden. In diesen Untersuchungen beobachteten wir, dass die Anwesenheit von PDGF-BB sowohl die Angiogenese als auch die Rekrutierung von Wirtszellen aus den FM und dem Myometrium in die TG-PEG-Hydrogele förderte. Diese Ergebnisse, zusammen mit dem hier etablierten Modell, legen den Grundstein für weiterführende Studien, welche heilungsmodulierende Mechanismen der FM in vivo untersuchen können.
Das noch bruchstückhafte Wissen über die FM-Biologie schränkt die Entwicklung der nächsten Generation von FM-reparierenden Biomaterialien erheblich ein. Mithilfe der Chromatographie-gekoppelten Massenspektrometrie (LC-MS) haben wir die bisher vollständigste Proteinzusammensetzung des menschlichen Amnions ermittelt. Unter anderem identifizierten wir eine Vielzahl von ECM und ECM-assoziierten Proteinen welche die Basis für neue FM optimierte Biomaterialien darstellen könnten.
Da es sich bei den FM um dynamische Gewebe handelt, die sich von der Empfängnis bis zur Geburt verändern, war der nächste logische Schritt die Untersuchung gepaarter Amnionproben aus dem 2. (Interventionszeitpunkt) und dem 3. (Entbindung) Schwangerschaftstrimester. Unsere Analyse ergab sehr unterschiedliche Proteinzusammensetzungen zwischen den beiden Schwangerschaftsstadien. Gewebe des mittleren Stadiums deuten auf aktive zelluläre Prozesse hin während spätere Gewebe eine Hochregulation von entzündungsregulierenden Proteinen aufweisen. Diese Studie zeigt signifikante Unterschiede in den biologischen Funktionen zwischen frühen und späten Amniongeweben auf. Darüber hinaus könnte sie helfen, regulatorischer Netzwerke, die das Wachstum und die Heilung von defektem Amniongewebe einschliessen, zu entschlüsseln.
Zusammenfassend stellt diese Arbeit durch in vitro- und in vivo-Amnionmodelle und durch die Charakterisierung von menschlichem Amnion eine reiche Informationsquelle für die Entwicklung neuer FM-heilender Biomaterialien dar. Wir zeigen, dass Wachstumsfaktor-beladene Biomaterialien sowohl in vitro als auch in vivo die Heilungsreaktion der FM anfachen können. Nach unserem besten Wissen stellen wir das derzeit umfassendste Proteom eines späten menschlichen Amnions zur Verfügung. Der Vergleich gepaarter Amnionproben aus frühen und späten Schwangerschaften gibt zudem erstmals Aufschluss über die physiologische Reifung des Amnions. Wir stellen uns vor, dass die Integration des hier gesammelten Wissens Inspiration für die Entwicklung von auf FM zugeschnittenen, heilungsauslösenden Biomaterialien der nächsten Generation liefern wird, um letztendlich iPPROM und Frühgeburten zu verhindern