Bone has an intrinsic regenerative potential and can heal scar-free upon injury. Nevertheless, one of the most common orthopedic problems worldwide are non-unions due to fracture healing complications. Hence, new therapeutic approaches need to be developed to reduce the risk of non-healing. Towards this aim, unraveling the underpinning mechanism that eventually lead to scar-free healing is of utmost importance. Upon injury a hematoma is formed intended mostly to stop excess bleeding, which subsequently gets remodeled. Both, the onset of de novo extracellular matrix (ECM) deposition and the development of vascular structures organize early soft callus tissues and are key parameters to achieve a successful healing outcome. Complete tissue regeneration requires a fine-tuned early hierarchy of assembly processes such that the architecture of the provisional ECM can provide spatial guidance to invading cells. A second task of the provisional ECM, which is rapidly remodeled in space and time due to reciprocal cell-ECM interactions, is to support their proliferation and differentiation into tissue specific cell types. Finally, scar-free healing can only be accomplished if the emerging tissue gets vascularized and it is well known that angiogenesis and the establishment of a functional vascular network is closely associated with bone formation and critical for scar-free healing. Despite the importance of these early processes, far too little is known how they get orchestrated and how ECM assembly correlates with the spatiotemporal initiation of angiogenesis in early bone healing.

The process of fracture healing is substantially influenced by the physical stability of the fracture fixation. Even in otherwise healthy settings the local biomechanical stability of a fracture determines success of healing:​ whether a scar-free healing or, if beyond certain thresholds of instability, a delayed or non-healing will occur. Micro-vascular self-assembly is also known to be highly mechano-sensitive. One of the key players of mechano-transduction in endothelial cells (ECs) that form the vasculature are nuclear transcriptional co-activators, i.e. Yes-associated protein 1 (YAP) and transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ). By sensing their local micro-environment cells respond to the physical properties of the ECM and organize their stress fibers accordingly leading to cytoskeletal changes. YAP/TAZ react upon those cytoskeletal changes and trans-locate to the nucleus where they interact with TEA domain family member (TEAD) transcription factors and control genes for cell proliferation, apoptosis, movement and cell fate decision. However, how the complex interplay of inner-vascular forces and external mechanical cues are integrated via endothelial YAP/TAZ in a complex in vivo setting remained elusive.

To fill this gap of knowledge we analyzed here for the first time how external mechanics and endothelial mechano-transduction via YAP/TAZ depend upon each other during bone healing. A mouse osteotomy model was used that is capable of complete, scar-free regeneration by stabilizing the fracture with a rigid fixator. We compared the principles of ECM assembly and micro-vascular re-establishment in such scar-free setting with one that results in delayed healing or even scarring by employing a semi-rigid fixator. Knockout of endothelial YAP/TAZ was induced prior to setting the osteotomy to modulate EC mechano-transduction during early remodeling phases. Surprisingly we found that vascularization of the hematoma was not dependent on EC YAP/TAZ mediated mechanosensation. Instead, external mechanical stability determines the architecture of the vascular structures in the osteotomy gap from early onward and overrules potential effects due to endothelial YAP/TAZ mechano-sensitivity. However, endothelial YAP/TAZ is required on the cellular level for the formation of stable EC-EC contacts during revascularization of the hematoma. A better understanding how external mechanical stability and cellular mechano-transduction jointly steer early hematoma remodeling, microvascular invasion and network formation may be helpful for the development of therapeutic approaches to enhance bone healing.

Bone forms through a cartilage phase via the process of endochondral ossification. Hereby, blood vessels invade a cartilage template that is subsequently remodeled to bone. It is frequently assumed that endochondral ossification during bone formation at the growth plate recapitulates the one during bone healing. Thus, we here assessed the spatio-temporal organization of matrix assembly and vessels at the cartilage bonetransition zone at the growth plate and compared this interdependency to the one in the osteotomy gap. We found that along the cartilage-bone transition zone at the growth plate vessels precede fibrillar collagen, whereas in the osteotomy gap a collagen layer is found between the cartilage tissue and the vascular front. Our data provide evidence that this might be due to hematoma-dependent differences in ECM remodeling, followed by vascular regression from the cartilage-osseo region in the osteotomy gap. Deciphering the implications of different vessel-collagen arrangement during endochondral ossification may contribute to understanding the factors required for bone formation.

Assembly and remodeling of the ECM also plays an essential role during pathological processes. The pathogenesis of viral myocarditis is highly complex with diverse clinical outcomes in patients. The lack of specific markers to distinguish healing and non-healing outcomes due to the plethora of factors that is involved in the regulation of inflammation constrains the prognosis of patients. In a collaborative effort we here analyzed the presence of distinct ECM signatures by probing the fibronectin tensional state, collagen content, and ECM-immune cell interactions in tissues of patients from different stages of inflammation. Our results suggest for unique patterns of ECM remodeling in the progression of inflammation. Further investigation in these lines can reveal inflammatory niches that drive the inflammation to specific outcomes and hence can present target pathways in myocardial wound-healing process.

Taken together, this thesis’ research not only leads to a more complete comprehension on the interdependency of external mechanical fracture stability and local endothelial mechano-transduction, but also provides a deeper understanding on how mechanical stability steers early hematoma remodeling and subsequent bone healing phases. These findings advance the fundamental understanding of the complex cellular interplay in bone healing and their dependency on mechanics. Eventually this understanding provides a translational perspective for the development of novel therapeutic approaches to enhance bone healing and reduce the risk of non-unions.

Knochen haben ein intrinsisches Regenerationspotenzial und können nach Verletzungen narbenfrei heilen. Dennoch ist eines der häufigsten orthopädischen Probleme weltweit die Nichtheilung („non-union“) von Knochenbrüchen aufgrund von Komplikationen bei der Frakturheilung. Daher müssen neue therapeutische Ansätze entwickelt werden, die das Risiko der Nichtheilung verringern. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es von größter Bedeutung, die zugrundeliegenden Mechanismen zu entschlüsseln, die letztendlich zu einer narbenfreien Heilung führen. Nach einer Verletzung bildet sich ein Hämatom, das in erster Linie dazu dient, übermäßige Blutungen zu stoppen, und das anschließend wieder abgebaut wird. Sowohl der Beginn der De-novo-Ablagerung der extrazellulären Matrix (EZM) als auch die Entwicklung vaskulärer Strukturen organisieren frühes weiches Kallusgewebe und sind Schlüsselparameter für ein erfolgreiches Heilungsergebnis. Eine vollständige Geweberegeneration erfordert eine fein abgestimmte frühe Hierarchie von Aufbauprozessen, damit die Architektur der provisorischen EZM den eindringenden Zellen eine räumliche Orientierung bieten kann. Eine zweite Aufgabe der provisorischen EZM, die aufgrund von Wechselwirkungen zwischen Zellen und EZM räumlich und zeitlich rasch umgebaut wird, besteht darin, die Proliferation und Differenzierung der Zellen in gewebespezifische Zelltypen zu unterstützen. Schließlich kann eine narbenfreie Heilung nur erreicht werden, wenn das entstehende Gewebe vaskularisiert wird, und es ist bekannt, dass die Angiogenese und die Etablierung eines funktionellen Gefäßnetzes eng mit der Knochenbildung verbunden und für eine narbenfreie Heilung entscheidend sind. Trotz der Bedeutung dieser frühen Prozesse ist viel zu wenig darüber bekannt, wie sie orchestriert werden und wie der Aufbau der EZM mit der räumlich-zeitlichen Initiierung der Angiogenese in der frühen Knochenheilung korreliert.

Der Prozess der Frakturheilung wird wesentlich von der physikalischen Stabilität der Frakturfixierung beeinflusst. Selbst bei ansonsten gesunden Menschen entscheidet die lokale biomechanische Stabilität einer Fraktur über den Erfolg der Heilung:​ ob eine narbenfreie Heilung oder, bei Überschreiten bestimmter Schwellenwerte für die Instabilität, eine verzögerte oder nicht stattfindende Heilung eintreten wird. Auch die mikrovaskuläre Selbstorganisation ist bekanntermaßen hochgradig mechanosensitiv. Einer der Hauptakteure der Mechanotransduktion in Endothelzellen, die das Gefäßsystem bilden, sind nukleare Transkriptions-Coaktivatoren, d.h. das Yes-assoziierte Protein 1 (YAP) und der transkriptionelle Co-Aktivator mit PDZ-bindendem Motiv (TAZ). Indem sie ihre lokale Mikroumgebung wahrnehmen, reagieren Zellen auf die physikalischen Eigenschaften der EZM und organisieren ihre Stressfasern entsprechend, was zu Veränderungen des Zytoskeletts führt. YAP/TAZ reagieren auf diese Zytoskelettveränderungen und verlagern sich in den Zellkern, wo sie mit den Transkriptionsfaktoren der TEA-Domänenfamilie (TEAD) interagieren und Gene für Zellproliferation, Apoptose, Bewegung und die Entscheidung über das Zellschicksal kontrollieren. Wie jedoch das komplexe Zusammenspiel von innervaskulären Kräften und externen mechanischen Reizen über das endotheliale YAP/TAZ in einer komplexen Invivo-Umgebung integriert wird, blieb bisher ungeklärt.

Um diese Wissenslücke zu schließen, haben wir hier zum ersten Mal analysiert, wie externe Mechanik und endotheliale Mechanotransduktion über YAP/TAZ während der Knochenheilung voneinander abhängen. Es wurde ein Osteotomiemodell der Maus verwendet, das eine vollständige, narbenfreie Regeneration ermöglicht, indem die Fraktur mit einem rigiden Fixateur stabilisiert wird. Wir verglichen die Prinzipien des Aufbaus der EZM und der Wiederherstellung der Mikrogefäße in einer solchen narbenfreien Umgebung mit einer verzögerten Heilung oder sogar Narbenbildung durch den Einsatz eines semi-rigiden Fixateurs. Vor der Osteotomie wurde ein Knockout des endothelialen YAP/TAZ induziert, um die Mechanotransduktion der Endothelzellen während der frühen Remodellierungsphasen zu modulieren. Überraschenderweise stellten wir fest, dass die Vaskularisierung des Hämatoms nicht von der YAP/TAZvermittelten Mechanosensitivität der Endothelzellen abhing. Stattdessen bestimmt die externe mechanische Stabilität die Architektur der vaskulären Strukturen im Osteotomiespalt von Anfang an und überlagert mögliche Auswirkungen der endothelialen YAP/TAZ-Mechanosensitivität. Allerdings ist endotheliales YAP/TAZ auf zellulärer Ebene für die Bildung stabiler endothelialer Zellkontakte während der Revaskularisierung des Hämatoms erforderlich. Ein besseres Verständnis darüber, wie externe mechanische Stabilität und zelluläre Mechanotransduktion gemeinsam den frühen Hämatomumbau, die mikrovaskuläre Invasion und die Netzwerkbildung steuern, könnte für die Entwicklung von therapeutischen Ansätzen zur Verbesserung der Knochenheilung hilfreich sein.

Knochen bildet sich über eine Knorpelphase durch den Prozess der endochondralen Ossifikation. Dabei dringen Blutgefäße in eine Knorpelvorlage ein, die anschließend zu Knochen umgebaut wird. Es wird häufig angenommen, dass die endochondrale Ossifikation während der Knochenbildung an der Wachstumsfuge diejenige während der Knochenheilung rekapituliert. Daher haben wir hier die räumlich-zeitliche Organisation des Matrixaufbaus und der Gefäße in der Knorpel-Knochen-Übergangszone an der Wachstumsfuge untersucht und diese Abhängigkeit mit derjenigen im Osteotomiespalt verglichen. Wir fanden heraus, dass entlang der Knorpel-Knochen-Übergangszone an der Wachstumsfuge die Gefäße dem fibrillären Kollagen vorausgehen, während sich im Osteotomiespalt eine Kollagenschicht zwischen dem Knorpelgewebe und der Gefäßfront befindet. Unsere Daten liefern Hinweise darauf, dass dies auf hämatomabhängige Unterschiede im Umbau der EZM zurückzuführen sein könnte, gefolgt von einer vaskulären Regression aus der Knorpel-Knochen-Region im Osteotomiespalt. Die Entschlüsselung der Auswirkungen der unterschiedlichen Gefäß-Kollagen-Anordnung während der endochondralen Ossifikation könnte zum Verständnis der für die Knochenbildung erforderlichen Faktoren beitragen.

Der Aufbau und Umbau der EZM spielt auch bei pathologischen Prozessen eine wesentliche Rolle. Die Pathogenese der viralen Myokarditis ist äußerst komplex und die klinischen Ergebnisse der Patienten sind unterschiedlich. Das Fehlen spezifischer Marker zur Unterscheidung zwischen heilenden und nicht heilenden Ergebnissen aufgrund der Vielzahl von Faktoren, die an der Regulierung der Entzündung beteiligt sind, schränkt die Prognose der Patienten ein. In einer Zusammenarbeit haben wir hier das Vorhandensein verschiedener extrazellulärer Matrixsignaturen analysiert, indem wir den Fibronektin-Spannungszustand, den Kollagengehalt und die EZM-Immunzell-Interaktionen in Geweben von Patienten in verschiedenen Entzündungsstadien untersucht haben. Unsere Ergebnisse deuten auf einzigartige Muster des Umbaus der EZM beim Fortschreiten der Entzündung hin. Weitere Untersuchungen in diesen Bereichen können entzündliche Nischen aufdecken, die die Entzündung zu bestimmten Ergebnissen führen, und somit Zielwege im myokardialen Wundheilungsprozess aufzeigen.

Insgesamt führt die Forschung im Rahmen dieser Arbeit nicht nur zu einem umfassenderen Verständnis der Wechselwirkung zwischen externer mechanischer Frakturstabilität und lokaler endothelialer Mechanotransduktion, sondern auch zu einem tieferen Verständnis der Frage, wie die mechanische Stabilität den frühen Hämatomumbau und die nachfolgenden Knochenheilungsphasen steuert. Diese Ergebnisse tragen zum grundlegenden Verständnis des komplexen zellulären Zusammenspiels bei der Knochenheilung und ihrer Abhängigkeit von der Mechanik bei. Letztendlich bietet dieses Verständnis eine translationale Perspektive für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zur Verbesserung der Knochenheilung und zur Verringerung des Risikos von Komplikationen bei der Frakturheilung