Cellulose is an abundant biopolymer that can be synthesized by many different organisms from all kingdoms of life with plants offering the highest availability. Cellulose-derived fibrils and particles with dimensions in the nanometer range are referred to as nanocellulose which is a nature-based nanomaterial with interesting- and potentially useful properties. Nanocellulose combines in a unique way the characteristic cellulose properties like the non-toxicity and a high biodegradability with the benefits of nanoscale materials like high surface area and mechanical strength. Understanding the material properties and effective modification strategies are crucial steps to introduce bioactive properties to nanocellulose and thus further facilitate their use in biomedical applications.

This thesis provides an in-depth understanding of how active proteins and peptides can be efficiently immobilized to nanocellulose, i.e. wood-derived nanocellulose (NFC), nanocellulose crystals (CNC) and bacterial cellulose (BC), and how control over the bioactivity of the resulting biocomposite material can be achieved. Different biochemical modification strategies based on physical, covalent, or bioaffinity immobilization procedures are explored and rationally designed using proteins with different biochemical and structural features. Moreover, the question of how the intricate mechanism of immobilization and modification affects both the biomolecules activity and, the physical properties of the nanocellulose substrate is answered.

By studying the physical adsorptive properties of TEMPO-oxidized nanofibrillated cellulose (TONFC) as a first proof-of-principle, it could be demonstrated that different biomolecules can be immobilized via tunable electrostatic interactions to the charged TONFC (Chapter 2). Moreover, a bottom-up functionalization strategy was reported and combined a spontaneous and tunable physical interaction and stable covalent bonding. Following this strategy, it was possible to produce a highly active TONFC-protease biocomposite material with increased enzymatic activity as compared to the soluble enzyme form. The described bottom-up functionalization strategy could be further improved by optimizing the covalent coupling step to immobilize a sensing protein (Chapter 3). A bio-hybrid copper-sensitive nanocellulose paper film was thus developed based on the red-fluorescent protein C-Phycocyanin (CPC). Although immobilization and covalent coupling led to changes in the copper sensitivity of CPC, the protein stability was significantly enhanced. In addition, the sensing paper films were demonstrated to be reusable for several cycles over several days with a maximal sensing performance in the nanomolar range and activity for example in human serum.

A closer look on the physical interactions of biomolecules and TONFC in more detail, pronounced effects on both the bioactivity and the material properties could be elucidated (Chapter 4). When the antimicrobial peptide (AMP) nisin was physically immobilized to TONFC, the fibril surface properties changed, undergoing unravelling and stiffening as could be elucidated by small angle X-ray scattering combined with model based data analysis. The effect was even more pronounced at basic pH. Compared to the nisin molecule in solution, the TONFC-nisin bio-nanocomposite suspension showed a marked enhanced antibacterial action against different bacterial strains, including a pathogenic S. aureus.

The increased bioactivity observed, was not restricted to the enzyme Papain and nisin. By engineering a second AMP tet009 to carry either a cellulose binding peptide (CBP) or cellulose binding protein motif (CBM), a one-step spontaneous immobilization on pristine cellulose of plant and bacterial origin, as fibrils or crystals, was achieved (Chapter 5). The interaction of tet009 with CBP and NFC or CNC significantly enhanced the antimicrobial activity of tet009 against both Gramnegative and Gram-positive pathogenic strains. These observations demonstrated that a bioaffinitybased functionalization strategy could be applied to different cellulose substrates without requiring the previous modification of cellulose. Furthermore, the absence of acute cytotoxicity of the plant and bacterial cellulose preparations used in this study was assessed and a procedure to reduce the inflammatory contaminants possibly present in nanocellulose preparations was developed. Endotoxin levels were thus reduced to levels acceptable for further in vitro and in vivo testing.

Through this work, biochemical surface modification strategies of nanocellulose were established and demonstrated to be feasible for the future development of functional nanocellulose-based biocomposite material concepts as enzyme carriers, point-of-care biosensors delivery vehicles for antimicrobial drugs. Besides, the absence of acute cytotoxicity and the low level of endotoxin contamination achieved for NFC and BC films are promising for a further systematic analysis of the immune response towards these materials and their future implementation in functional coatings of implants, wound dressings or other biomedical applications.

Auf der Erde ist Zellulose ein omnipräsentes Biopolymer, welches von einer Vielzahl an Organismen synthetisiert werden kann. Vor allem wird es aber in verschiedensten Ausführungen von Pflanzen gebildet. Zellulosefibrillen und Partikel mit Abmessungen im Nanometerbereich werden als Nanozellulose definiert, einem natürlichen Nanomaterial mit herausragenden Eigenschaften. Nanozellulose kombiniert in einzigartiger Weise die charakteristischen Merkmale von Zellulose, wie z.B. der unbedenklichen Toxizität und guten biologischen Abbaubarkeit, mit den Vorteilen nanoskalierter Materialen, wie der großen Oberfläche und mechanischen Belastbarkeit. Für viele Anwendungen, z.B. in der Bio-medizin, ist eine jedoch weitere Funktionalisierung mit (bio-)aktiven Gruppen nötig. Dies erfordert ein tiefgreifendes Verständnis von Materialeigenschaften und –Chemie.

Diese Doktorarbeit soll ein tiefgreifendes Verständnis darüber vermitteln, wie bioaktive Proteine und Peptide auf Nanozellulose immobilisiert werden können, beispielsweise auf Holz-basierte Nanozellulose (NFC), Nanozellulose Kristall Partikel (CNC) oder bakterielle Zellulose (BC), und wie die Bioaktivität des so produzierten Biokomposit-Materials effektiv kontrolliert werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit werden zudem verschiedene biochemische Modifizierungsstrategien entwickelt, basierend auf physikalischen-, kovalenten- oder Bioaffinitätswechselwirkungen, und zielgerichtet weiterentwickelt für Biomoleküle mit unterschiedlichsten biochemischen und strukturellen Eigenschaften. Zudem wird versucht die Frage zu beantworten, wie sich die komplexen Mechanismen der Immobilisierung und Modifikation auf die Aktivität des Biomoleküls, aber auch auf die physikalischen Eigenschaften des Nanozellulose Trägermaterials auswirken können.

Bei der umfassende Analyse der physikalischen Adsorption von verschiedenen Biomolekülen auf TEMPO-oxidierter nanofibrillierter Zellulose (TONFC) konnte in einem “Proof-of-Principle“ Ansatz gezeigt werden, dass (Bio-)moleküle durch die Justierung der elektrostatischen Interaktionen auf geladener TONFC immobilisiert werden können (Kapitel 2). Anschliessend wurde im Rahmen einer “bottom-up” Strategie dieser Ansatz mit einer chemischen Anbindung der Moleküle an die TONFC weiterentwickelt. Mit Hilfe dieser Strategie war es nun möglich hochreaktive TONFC-Protease Biokomposit Materialien herzustellen, die im Vergleich zu der ungebundenen Protease eine erhöhte Aktivität aufwiesen. In einem weiteren Schritt wurde die Protease durch ein funktionelles “Sensor”- Protein ersetzt und die Immobilisierungsstrategie entscheidend weiterentwickelt (Kapitel 3). Dabei konnten basierend auf dem roten Fluoreszenzprotein C-Phycocyanin (CPC) bio-hybride, Kupfersensitive Papierfilme aus Nanozellulose hergestellt werden. Obwohl die kovalente Immobilisierung des Proteins im Vergleich zu seiner löslichen Form zu einer Abnahme der Sensitivität führte, war die Stabilität jedoch deutlich erhöht. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass der Biosensor aus Papier nicht nur in komplexen Medien, wie z.B. humanem Serum, eine Nachweisgrenze im nanomolaren hatte, sondern auch über mehrere Tage hinweg wiederverwendet werden konnte.

In einer darauffolgenden detaillierten Analyse der physikalischen Interaktionen zwischen den Biomolekülen und der TONFC konnte einen signifikanten Effekt sowohl auf die Bioaktivität als auch auf die Eigenschaften der Zellulose nachweisen. (Kapitel 4)

Dazu wurden mittels Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) in Kombination mit einer mathematischen Strukturmodellierung die räumlichen Dimensionen von TONFC mit und ohne interagierendes Biomolekül untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die nicht-kovalente Immobilisierung des antimikrobiellen Peptides (AMP) Nisin die physikalischen Eigenschaften der Fasern veränderte und zu einer Versteifung der Zellulosefasern führte. Dieser Effekt war pH abhängig und verstärkt bei basischem pH zu beobachten. Bemerkenswerterweise konnte beim anschliessende Vergleich der antimikrobiellen Eigenschaften festgestellt werden, dass die antimikrobielle Wirksamkeit der Suspension aus TONFC-Nisin Biokomposite deutlich erhöht war im Vergleich zur löslichen Form des Nisins. So konnte demonstriert werden, dass durch den Einsatz der TONFC-Nisin Biokomposite Bakterien verschiedenster Stämme, vor allem aber auch pathogene Krankheitserreger wie S. aureus, weitaus effizienter abgetötet werden können als mit Nisin in Lösung.

Interessanterweise war die grundlegend verbesserte Bioaktivität nach Immobilisierung auf den Zellulosefasern nicht nur auf die das Enzym Papain oder das Peptid Nisin beschränkt. So wurde in einem weiteren Ansatz ein neues AMP (tet009) entwickelt, welches über eine zusätzliche Zellulosebindende Peptiddomäne verfügt. Dies ermöglichte eine spontane, selbstorganisierte und gerichtete Immobilisierung der Peptide auf Zellulose, unabhängig von deren Ursprung (Pflanzen oder Bakterien) oder Form (Fasern oder Kristalle). (Kapitel 5) Die Interaktion von tet009 mit CBP, NFC oder CNC und die antimikrobiellen Eigenschaften gegen Gram-negative und Gram-positive Stämme waren deutlich verstärkt im Vergleich zur Variante ohne Zellulose-bindende Peptiddomäne. Dies verdeutlicht, dass eine solche auf Bio-Affinität basierte Strategie eine Funktionalisierung verschiedenster Zellulosesubstrate ermöglicht, ohne dass diese vorher (chemisch) modifiziert werden müssen.

Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit die Zytotoxizität von pflanzlicher und bakterieller Zellulose untersucht und ein Verfahren entwickelt um mögliche endzündungsauslösende Bestandteile der Materialien wie Endotoxine zu inaktivieren. Dabei konnten die Endotoxin Level auf ein für weitere in vitro und in vivo Studien unbedenkliches Maß reduziert werden.

Zusammengefasst wurden im Rahmen der vorliegenden Thesis neben einem tiefgreifenden physikalisch-chemischen Verständnis neue Strategien für die biochemische Funktionalisierung von Nanozellulose entwickelt und etabliert, die entscheidend sind für zukünftige Konzepte wie z.B. Enzym-Träger, Biosensoren oder aber auch Transporter für antimikrobielle Wirkstoffe. Da sichergestellt werden konnte, dass die Endotoxin Level auf ein unbedenklichen Level gesenkt werden können, sind Filme aus NFC und BC zudem vielversprechende Substrate für weitere systematische Analysen der Immunantwort auf diese Materialien sowie für den Einsatz als funktionelle Beschichtung von Implantaten, Wundverbänden oder vielfältige biomedizinischen Anwendungen.