In the 1990s, thousand-year-old mummies were exhumed at an excavations site in the southern tip of Peru. The exhumed mummies included the mummified body of a woman in her mid thirties who presented an abnormal growth on the bone of her upper arm. Such bone tumors are classified as an orphan disease due to their low prevalence in the general public, have a peak incidence in children and adolescents, and have a high mortality rate. The high mortality rate stems, to a large degree, from cancer cells disseminating from the primary tumor and forming a secondary lesion in a process known as metastasis. Liquid biopsies, such as blood samples, therefore present a unique opportunity to isolate these disseminated tumor cells in order to gain patient specific diagnostic insight. An ideal method to isolate biological cells from liquid biopsies would not require labelling of the sample and would not diminish the cell viability. Acoustofluidics, a contactless and label-free method known to not decrease cell viability, exploits an acoustic field within a fluid cavity to manipulate objects in a fluid. Many variations of acoustofluidic devices have been developed, which include bulk acoustic wave (BAW) devices, where a standing pressure wave determines the position of objects within the fluid cavity of the BAW device. BAW devices have already been tested for the isolation of cancer cells in research settings. Although these preliminary studies demonstrated that BAW devices can be used to isolate cancer cells, there are limiting factors for BAW devices to be employed outside of research settings. This thesis focuses on how BAW devices can be improved to successfully isolate cancer cells from a liquid biopsy and how to measure the dynamic material properties of biological cells.
An actuating element, usually a piezoelectric transducer manually attached to the BAW device, is excited at a frequency at which a standing pressure wave can be established in the fluid cavity. The continuous focusing and subsequently isolation of cancer cells from fluids therefore prerequisites that the optimal excitation frequency to establish a standing pressure wave can be found and dynamically altered. Many approaches are found in literature how to achieve a stable optimal excitation frequency, such as improving the BAW device design and fabrication. These approaches however only optimize the theoretical focusing efficiency. Another approach is to take the real time video feed of the focusing of the objects in the fluid as the control parameter of a feedback control loop (FCL). This thesis details the implementation of a FCL which can dynamically alter the excitation frequency in order to minimize the object distribution, quantified by the light intensity distribution, within the fluid cavity without increasing the cost or complexity of the system. The suggested FCL is not only straightforward and autonomous, it furthermore outperforms a skilled human operator. The FCL performed tasks otherwise difficult, such as focusing 600 nm diameter polystyrene particles in flow, whereas the optical system was the limiting factor to determine how small the objects could be and still be focused. Future work building upon this FCL could include looking into changing the input variable, e.g. transitioning from a video feed to a light sheet, which could reduce the space requirements and could help to bring BAW devices closer to bedside applications. Furthermore, the FCL could be altered for the use in device multiplexing, cell patterning or organoid formation, depending on the input parameter.
Isolating biological cells is however only a first step. An ever growing research field focuses on measuring the material properties of biological cells. Knowing the material properties can lead to an increased diagnostic insight and is crucial information when designing acoustofluidic systems which rely on the relative compressibility and density differences between the object in the fluid and the fluid, which is characterized by the acoustic contrast factor (ACF). The hypothesis is explored if known static material properties of a bone cancer cell line with low and high metastatic potential can be used as a predictor for the dynamic material properties. The cancer cells were placed in an acoustic field and their movement is compared to reference objects in the fluid in order to calculate the dynamic material properties of the cancer cells. The study did not show a difference in the dynamic material properties between the two metastatic potentials. This is highly relevant as the cancer cells used in this study decrease in size as they become more malignant. The higher metastatic potential cancer cells will therefore be harder to manipulate, due to their smaller size but similar ACF, which is a crucial takeaway. Furthermore, this study includes a more in depth analysis, by altering the stiffness of the parental cell line and implementing a numerical model, which demonstrates the influence of various material properties, such as the stiffness, compressibility and density. The insights gained during this thesis highlight the gap in the understanding of the coupling between static and dynamic material properties, which needs to be addressed.
The woman with the bone tumor would not have been cured by acoustofluidic devices. But the research presented here could have helped in detecting her tumor and led to insights about her disease progression.
In den 1990er Jahren wurden an einer Ausgrabungsstätte an der Südspitze Perus tausend Jahre alte Mumien exhumiert. Unter den exhumierten Mumien befand sich auch der mumifizierte Körper einer Frau Mitte dreissig, die einen anomalen Wuchs am Knochen ihres Oberarms aufwies. Solche Knochentumore werden als Waisenkrankheiten eingestuft, da sie in der Allgemeinbevölkerung kaum vorkommen, am häufigsten bei Kindern und Jugendlichen auftreten und eine hohe Sterblichkeitsrate haben. Die hohe Sterblichkeitsrate ist zu einem grossen Teil darauf zurückzuführen, dass sich Krebszellen vom Primärtumor loslösen und in einem als Metastasierung bezeichneten Prozess eine sekundäre Läsion bilden. Flüssigbiopsien, wie z. B. Blutproben, bieten daher eine interessante Möglichkeit Tumorzellen zu isolieren, um patientenspezifische diagnostische Erkenntnisse zu gewinnen. Eine ideale Methode zur Isolierung von Zellen aus Flüssigbiopsien würde keine Markierung der Zellen erfordern und die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigen. Die Akustofluidik, eine berührungslose und markierungsfreie Methode, von der bekannt ist, dass sie die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt, nutzt ein akustisches Feld um Objekte in einer Flüssigkeit zu manipulieren. Es wurden bereits zahlreiche Varianten von akustofluidischen Geräten entwickelt, darunter auch Bulk Acoustic Wave (BAW)-Geräte, bei denen eine stehende Druckwelle die Position von Objekten im Flüssigkeitshohlraum des BAW-Geräts bestimmen. BAW-Geräte wurden bereits für die Isolierung von Krebszellen in der Forschung getestet. Obwohl diese vorläufigen Studien gezeigt haben, dass BAW-Geräte zur Isolierung von Krebszellen verwendet werden können, gibt es einschränkende Faktoren für den Einsatz von BAW-Geräten ausserhalb von Forschungseinrichtungen. In dieser Arbeit wird untersucht, wie BAW-Geräte verbessert werden können um Krebszellen aus einer Flüssigbiopsie erfolgreich zu isolieren, und wie die dynamischen Materialeigenschaften von biologischen Zellen gemessen werden können.
Ein Antriebselement, in der Regel ein piezoelektrischer Wandler, der manuell am BAW-Gerät angebracht ist, wird mit einer Frequenz angeregt, bei der sich eine stehende Druckwelle im Flüssigkeitshohlraum aufbauen kann. Die stehende Druckwelle bestimmt die Position des Objekts im Flüssigkeitshohlraum. Die kontinuierliche Fokussierung und anschliessende Isolierung von Krebszellen aus Flüssigkeiten setzt daher voraus, dass die optimale Anregungsfrequenz zur Erzeugung einer stehenden Druckwelle gefunden und dynamisch verändert werden kann. In der Literatur finden sich viele Ansätze, wie eine stabile optimale Anregungsfrequenz erreicht werden kann, z. B. durch Verbesserung des Designs und der Herstellung von BAW-Geräten. Diese Ansätze optimieren jedoch nur die theoretische Fokussierungseffizienz. Ein anderer Ansatz besteht darin, EchtzeitVideobilder der Fokussierung der Objekte in der Flüssigkeit als Steuerparameter für einen Rückkopplungsregelkreis (feedback control loop - FCL) zu verwenden. In dieser Arbeit wird die Implementierung eines FCLs beschrieben, der die Anregungsfrequenz dynamisch ändern kann, um die Objektverteilung, quantifiziert durch die Lichtintensitätsverteilung, innerhalb des Fluidhohlraums zu minimieren, ohne die Kosten oder die Komplexität des Systems zu erhöhen. Der vorgeschlagene FCL ist nicht nur einfach und autonom, sondern übertrifft auch die Leistung eines erfahrenen menschlichen Bedieners. Der FCL erfüllte Aufgaben die sonst schwierig sind, wie z. B. die Fokussierung von 600 nm Durchmesser Polystyrolpartikeln in der Strömung, wobei das optische System der begrenzende Faktor war, um zu bestimmen, wie klein die Objekte sein können und dennoch fokussiert werden können. Zukünftige Arbeiten, die auf diesem FCL aufbauen, könnten eine Änderung der Eingangsvariablen beinhalten, z. B. den Übergang von einem Videofeed zu einem Laserlichtschnitt, was den Platzbedarf verringern und dazu beitragen könnte, BAW-Geräte näher an Anwendungen am Krankenbett zu bringen. Darüber hinaus könnte der FCL, je nach Eingangsparameter, für die Verwendung bei der Multiplexierung von Geräten, der Zellstrukturierung oder der Bildung von Organoiden geändert werden.
Die Isolierung von Krebszellen ist jedoch nur ein erster Schritt. Ein ständig wachsendes Forschungsgebiet konzentriert sich auf die Messung der Materialeigenschaften von biologischen Zellen. Die Kenntnis der Materialeigenschaften kann zu einem verbesserten diagnostischen Einblick führen und ist eine entscheidende Information bei der Entwicklung von akustofluidischen Systemen, die auf der relativen Kompressibilität und den Dichteunterschieden zwischen dem Objekt in der Flüssigkeit und der Flüssigkeit beruhen, welche den akustischen Kontrastfaktor (acoustic contrast factor - ACF) definieren. Die Hypothese wird untersucht, ob bekannte statische Materialeigenschaften einer Knochenkrebszellkultur mit niedrigem und hohem Metastasierungspotenzial als Prädiktor für die dynamischen Materialeigenschaften verwendet werden können. Die Krebszellen wurden in einem akustischen Feld platziert und ihre Bewegung wurde mit Referenzobjekten in der Flüssigkeit verglichen, um die Materialeigenschaften der Krebszellen zu berechnen. Die Studie zeigte keinen Unterschied in den dynamischen Materialeigenschaften zwischen den beiden Krebszellkulturen mit unterschiedlichem Metastasenpotenzial. Dies ist von Bedeutung, da die in dieser Studie verwendeten Krebszellen mit zunehmender Bösartigkeit kleiner werden. Die Krebszellen mit höherem Metastasierungspotenzial sind daher aufgrund ihrer geringeren Grösse, aber ähnlichem ACF schwieriger zu manipulieren, was eine wichtige Erkenntnis ist. Darüber hinaus beinhaltet diese Studie eine umfassendere Analyse, indem die Steifigkeit der Ursprungszellkultur verändert und ein numerisches Modell implementiert wurde, das den Einfluss verschiedener Materialeigenschaften wie Steifigkeit, Kompressibilität und Dichte aufzeigt. Die gewonnenen Erkenntnisse zeigen, dass es eine grosse Lücke im Verständnis zwischen der Kopplung von dynamischen und statischen Materialparametern gibt, die es zu beseitigen gilt.
Die Frau mit dem Knochentumor wäre durch akustofluidische Geräte nicht geheilt worden. Aber die hier vorgestellte Forschung hätte bei der Erkennung ihres Tumors helfen und zu Erkenntnissen über ihren Krankheitsverlauf führen können.