La modulation mécanique de la croissance osseuse a des implications dans la progression des déformations musculo-squelettiques telles que la scoliose idiopathique adolescente. Ce processus présente aussi un intérêt croissant pour le développement et l'amélioration des approches minimalement invasives de correction de ces déformations musculo-squelettiques en modulant localement la croissance osseuse, tout en préservant la croissance normale ainsi que les fonctions et mobilités segmentaires. La croissance longitudinale des os longs et des vertèbres s’effectue au droit des plaques de croissance, qui sont divisées en trois zones histologiques distinctes (réserve, proliférative et hypertrophique). La matrice extracellulaire de la plaque de croissance est principalement composée d'eau et de protéoglycanes imbriquées dans des fibrilles de collagène de type II, qui sont considérées comme des composants déterminants des propriétés biomécaniques des tissus cartilagineux. Des études antérieures ont étudié le comportement biomécanique des plaques de croissance, mais aucune étude n’a à ce jour analysé le comportement mécanique en compression de la plaque de croissance et de ses zones in situ à l'égard de sa composition biochimique et de l'organisation de ses fibres de collagène. L'objectif principal de cette étude était de déterminer les caractéristiques histomorphologiques et le comportement mécanique des plaques de croissance aux niveaux cellulaire et tissulaire, d'évaluer la composition biochimique et l'orientation des fibres de collagène de la plaque de croissance dans ses trois zones distinctes, puis d'établir des associations entre le comportement mécanique et la composition biochimique de la plaque de croissance.

Cinq groupes d’explants de plaques de croissance provenant de porcs âgés de quatre semaines ont été utilisés dans ce projet. Le premier groupe d’explants (N=12) a été utilisé pour caractériser l’histomorphologie 3D de la plaque de croissance in situ aux niveaux cellulaire (volume, aire surfacique, sphéricité, et rayons mineur/majeur) et tissulaire (ratio cellule/matrice extracellulaire), en utilisant un marquage fluorescent du cytoplasme cellulaire (Calcéine AM) couplé à la reconstruction 3D des coupes sériées d’images numériques confocales (logiciel IMARIS). Afin de caractériser le comportement mécanique sous compression de la plaque de croissance et de ses cellules constitutives en 3D, un second groupe d’explants de cartilage de croissance (N=6), dont les cytoplasmes cellulaires ont été marqués à la Calcéine AM, a été testé sous compression semiconfinée en relaxation de contraintes à l’aide d’un montage combinant un appareil de micro- chargement fixé sur un microscope confocal inversé. Ces explants ont été soumis à une déformation totale de 15% (5% pré-chargement et 10% de déformation) à un taux de 1.7x10⁻³ s⁻¹ jusqu’à l’obtention de l’équilibre, suivant un critère de relaxation de 8E-6 N/sec. Des coupes sériées d’images numériques des cytoplasmes cellulaires marqués ont été acquises par microscopie confocale avant chargement et après relaxation du tissu. Des reconstructions 3D des chondrocytes dans les conditions pré- et post-chargement ont été complétées à partir d’images prises séparément dans les trois zones des plaques de croissance. Différents paramètres morphométriques au niveau cellulaire (volume, aire surfacique, sphéricité et rayons mineur/majeur) et au niveau tissulaire (ratio cellule/matrice extracellulaire) ont été évalués (logiciel IMARIS) puis comparés à l’aide de tests statistiques pour les trois zones de la plaque de croissance. Afin de caractériser le comportement mécanique sous compression de la plaque de croissance au niveau tissulaire, un troisième groupe d’explants de cartilage de croissance (N=7), dont les noyaux cellulaires ont été marqués au Syto-17, a été testé sous compression semiconfinée en relaxation de contraintes à l’aide du même montage et des mêmes paramètres de chargement. Des images numériques des noyaux des chondrocytes marqués ont été acquises par microscopie confocale avant chargement et après relaxation du tissu, puis les champs de déformation 2D ont été déterminés à l’aide d’un algorithme de corrélation d'images appliqué à des paires d'images d’un même explant. Au niveau biochimique, un quatrième groupe d’explants (N=7) du même modèle animal a été analysé pour obtenir leurs contenus en eau, en glycosaminoglycanes sulfatés (S-GAG) et en hydroxyproline (OH-Pro), comme une mesure de leurs contenus en collagène, dans les trois zones histologiques de la plaque de croissance. La teneur en eau a été déterminée par pesée des tissus avant et après lyophilisation. Les contenus en collagène et en GAG ont été quantifiés à l'aide des essais d'hydroxyproline et de bleu de diméthylméthylène (DMMB), respectivement. Finalement, dans un cinquième groupe d’explants (N=7) du même modèle animal, l’organisation des fibres de collagène a été évaluée dans les trois zones histologiques de la plaque de croissance en utilisant la microscopie en lumière polarisée (PLM).

Les caractéristiques histomorphologiques de la plaque de croissance aux niveaux tissulaire et cellulaire sont hétérogènes et dépendent de la zone de la plaque de croissance. Des variations significatives de la morphologie des chondrocytes ont été observées entre les différentes zones histologiques. Les volumes et les aires surfaciques maximaux des chondrocytes ont été trouvés dans la zone hypertrophique par rapport à ceux des zones de réserve et proliférative. Le volume et l’aire surfacique des chondrocytes ont augmenté d'environ cinq et trois fois respectivement en se rapprochant de la jonction chondro-osseuse à partir de la zone de réserve. Les chondrocytes de la zone proliférative ont été les cellules de formes les plus discoïdes entre les trois différentes zones histologiques. Des différences significatives ont aussi été observées concernant le ratio cellule/matrice extracellulaire entre les trois zones. Le minimum et le maximum des ratios cellule/matrice extracellulaire ont été identifiés dans les zones de réserve et proliférative, respectivement.

Les analyses morphologiques tridimensionnelles aux niveaux tissulaire et cellulaire sous compression, basées sur des explants marqués à la Calcéine AM, des coupes sériées d’images numériques des cytoplasmes cellulaires et des reconstructions 3D des chondrocytes dans les conditions pré- et post-chargement, démontrent que la plaque de croissance subit des déformations non uniformes sous chargement tant au niveau tissulaire qu’au niveau cellulaire, et également au niveau du ratio cellule/matrice extracellulaire. De plus grandes déformations cellulaires (changement de volume cellulaire normalisé au volume initial) ont été trouvées dans les zones proliférative et hypertrophique. Inversement, les plus faibles déformations se sont développées dans la zone de réserve. Suite à la compression, le ratio cellule/matrice extracellulaire a diminué dans les zones de réserve et hypertrophique alors qu’il a augmenté dans la zone proliférative.

L’analyse biomécanique au niveau tissulaire, basée sur des explants marqués au Syto-17, l’imagerie 2D et la corrélation numériques d'images (DIC), a démontré un comportement mécanique hétérogène dépendamment de la zone de la plaque de croissance considérée. Des déformations tissulaires axiales supérieures se sont développées dans la zone proliférative par rapport aux deux autres zones histologiques. Par ailleurs, des déformations transverses plus élevées ont été principalement trouvées dans les zones proliférative et hypertrophique par rapport à la zone de réserve. Enfin, les déformations transverses et axiales les plus faibles et les plus homogènes se sont principalement développées dans la zone de réserve.

Les analyses biochimiques ont indiqué que la zone de réserve a un contenu en collagène plus élevé par rapport aux zones proliférative et hypertrophique. Cependant, les contenus en eau et en GAG ont été évalués identiques dans les trois zones histologiques.

Les caractérisations en microscopie polarisée ont montré que les fibres de collagène de la zone de réserve sont principalement orientées parallèlement à l’interface entre la plaque de croissance et l’os, soit perpendiculairement à l'axe longitudinal des os. Toutefois, certaines fibres orientées longitudinalement ont également été observées dans cette zone. A l'inverse, les fibres de collagène ont été trouvées alignées presqu'exclusivement selon l'axe longitudinal de l'os, soit dans la direction de croissance, pour les zones proliférative et hypertrophique.

Au niveau histomorphologique, les hétérogénéités marquées de la taille des cellules à travers les différentes zones histologiques de la plaque de croissance sont cohérentes avec celles des études antérieures sur la morphologie des chondrocytes à l'aide de l'histologie conventionnelle et des méthodes stéréologiques. Les chondrocytes subissent les changements de forme tout en progressant de la zone de réserve à la jonction chondro-osseuse. Les chondrocytes hypertrophiques et réserves sont ronds par rapport aux chondrocytes aplatis de la zone proliférative, tel que confirmé par les valeurs significativement plus faibles de sphéricité des chondrocytes prolifératifs par rapport aux zones de réserve et hypertrophique. La morphologie tissulaire et cellulaire peut avoir des contributions notables sur le comportement de la plaque de croissance durant le processus de croissance. La capacité d’obtenir la morphométrie cellulaire in situ et de surveiller les changements dans la direction de la croissance pourrait améliorer notre compréhension des mécanismes par lesquels la croissance anormale est déclenchée.

Deuxièmement, les chondrocytes et leur matrice extracellulaire environnante subissent des changements morphologiques significatifs avec la compression, mais le niveau de déformation dépend de la zone histologique. Ces déformations variables sont probablement liées aux propriétés mécaniques hétérogènes des trois zones, où la zone de réserve a été trouvé plus rigide que les zones proliférative et hypertrophique dans les directions parallèle et perpendiculaire à l'axe de compression. Dans notre étude, les chondrocytes hypertrophiques ont montré les plus grandes déformations parmi les trois zones histologiques;​ ils pourraient ainsi être davantage susceptibles de déclencher des messages biologiques altérés, via un étirement plus important de leur membrane cellulaire, ce qui modulerait l'activité des ARN-messagers et pourrait éventuellement provoquer une décélération de croissance sous compression mécanique.

Le contenu en collagène de la plaque de croissance et l'orientation de ses fibres de collagène sont également non uniformes à travers l'épaisseur de la plaque de croissance. La dispersion aléatoire des chondrocytes dans la zone de réserve et la disposition en colonnes des chondrocytes dans les zones proliférative et hypertrophique sont en corrélation avec l'orientation des fibres de collagène observées dans ces zones. En outre, nos données corroborent les données existantes sur le contenu biochimique de la plaque de croissance.

Enfin, le comportement biomécanique de la plaque de croissance sous compression est lié à son contenu en collagène et à l'organisation des fibres de collagène. La zone de réserve, moins sensible aux déformations comparé aux zones proliférative et hypertrophique, contient le contenu maximum en collagène avec des fibres alignées perpendiculairement à la direction de croissance. A l'inverse, les zones proliférative et hypertrophique, où un contenu en collagène inférieur et des fibres de collagène organisées longitudinalement ont été trouvés, s’avèrent plus sensibles aux déformations, tant aux niveaux cellulaire que tissulaire. La zone de réserve, plus rigide, pourrait jouer un rôle plus significatif de support mécanique comparativement aux zones proliférative et hypertrophique, qui seraient plus susceptibles d’être impliquées dans le processus de modulation de la croissance. Ces données s'ajoutent à notre compréhension de la relation entre les forces de compression subies par les chondrocytes de la plaque de croissance et de leur environnement extracellulaire.

Les principales limites de ce projet de recherche comprennent l'utilisation d'un modèle animal unique sans tenir compte des variations pouvant exister entre sites osseux et avec les stades de développement. La petite taille de l’échantillonnage ainsi que des analyses statistiques limitées pour établir des relations entre le comportement mécanique et les caractéristiques structurelles constituent aussi des limites de la présente étude. En contrepartie, cette étude est la première à offrir des informations importantes et complémentaires sur le comportement mécanique et les caractéristiques morphologiques et structurelles de la plaque de croissance ainsi que sur leurs relations pour un modèle animal avec un taux de croissance plus faible qui s'apparente davantage à celui des humains.

Les trois hypothèses de cette étude stipulaient que:​ 1) les trois zones de la plaque de croissance présentent différentes caractéristiques histomorphologiques, 2) les déformations cellulaires et les champs de déformation au niveau tissulaire sous compression sont non uniformes dans les trois zones de la plaque de croissance, et 3) le comportement biomécanique de la plaque de croissance en compression est relié à la composition biochimique de sa matrice extracellulaire (le contenu en GAG et en collagène), sa teneur en eau ainsi que l’organisation de ses fibres de collagène type II dans les trois zones de la plaque de croissance. Basé sur les résultats obtenus, ces hypothèses sont vérifiées pour 1) et 2) et en partie confirmées pour 3).

En conclusion, les zones histologiques les plus activement impliquées dans la croissance longitudinale osseuse (proliférative et hypertrophique) seraient plus sensibles aux contraintes de compression aux niveaux cellulaire et tissulaire dû à leurs caractéristiques histomorphologiques et structurelles, et donc davantage susceptibles d’être impliquées dans la progression des déformations musculo-squelettiques infantile et juvénile. Une connaissance combinée de la mécanique et mécanobiologie de la plaque de croissance est essentielle afin de mieux comprendre les mécanismes par lesquels la croissance anormale est déclenchée et, à plus long terme, afin d'améliorer les approches de traitement minimalement invasive des malformations squelettiques progressives, qui exploitent directement le processus de modulation de croissance pour corriger ces déformations.

Mechanical loading has key implications in the progression of infantile and juvenile musculoskeletal deformities. Furthermore, the mechanical modulation of growth is of growing interest in the development and improvement of minimally invasive approaches that aim at modulating local bone growth while preserving the natural growth and functions of bone and bone segments. Longitudinal growth of long bones and vertebrae occurs in growth plates, which are divided into three distinct histological zones (reserve, proliferative and hypertrophic). Growth plate extracellular matrix is composed of water, large aggregating proteoglycans embedded within type II collagen fibrils, which are believed to be a critical determinant of tissue biomechanical competence. Previous studies have investigated the biomechanical behaviour of growth plates but no study up to date has comprehensively analyzed the zonal growth plate compressive mechanical behaviour in situ with respect to its biochemical composition and collagen fiber organization. The main objective of this study was to characterize the histomorphological characteristics and mechanical behaviour of growth plates at both cellular and tissue levels and to evaluate the biochemical composition and collagen fiber orientation of growth plate tissue in the three functionally distinct zones and to further establish associations between zonal mechanical behavior and biochemical composition of the growth plate.

Five groups of growth plate explants from 4-week old swine were used in this project.The first group of explants (N=12) was used to characterize the 3D zonal histomorphology of in situ growth plate at the cellular (volume, surface area, spherecity, minor/major radii) and tissue (cell/matrix volume ratio) levels using fluorescent labeling of cell cytoplasm (Calcein AM) coupled with 3D reconstruction of serial confocal sections (IMARIS software). In order to characterize the three-dimensional compressive mechanical behaviour of the growth plate tissue and its constitutive cells, a second group of growth plate explants (N = 6), labeled with Calcein AM for cell cytoplasm, were tested in semi-confined compression under stress relaxation using a loading apparatus mounted on the stage of an inverted confocal microscope. These explants were subjected to 15% compressive strain (5% pre-strain and 10% strain) at a rate of 1.7x10⁻³ s⁻¹ until equilibrium. Serial sections of Calcein AM loaded explants were taken at two time points:​ prior to compression loading and after tissue relaxation. Three dimensional reconstruction of the serial sections taken pre-and post loading were completed from images taken separately in three zones of growth plates. Morphometric parameters at cellular level (volume, surface area, sphericity, and the minor/major radii) and at tissue level (cell/extracellular matrix ratio) were evaluated (IMARIS software) and compared for the three zones of the growth plate using statistical tests. In order to characterize the compressive mechanical behaviour of the growth plate at tissue level, a third group of growth plate explants (N=7), labeled with Syto-17 for cell nuclei, were tested in semi-confined compression under stress relaxation using the same loading apparatus mounted on the stage of an inverted confocal microscope and the same loading parameters. Single images of Syto-17 loaded explants were taken at two time points:​ prior to compression loading and after tissue relaxation. Digital image correlation (DIC) was performed on 2D image pairs to obtain strain distribution through the growth plate thickness using a costum-designed image correlation algorithm. At the biochemical level, a fourth group of explants (N=7) from the same animal model were assayed for water content, total sulfated glycosaminoglycan (S-GAG) content and hydroxyproline (OH-Pro), as a measure of collagen content, in the three distinct histological zones. Water content was determined by weighing the tissue before and after lyophilisation. Collagen and GAG content was quantified using hydroxyproline assay and dimethylmethylene blue (DMMB) assay, respectively. Finally, in a fifth group of explants (N=7), collagen fiber organization was evaluated in the three histological zones of growth plate using polarized light microscopy.

Histomorphological analyses of growth plate at tissue and cellular levels revealed the heterogeneous and zone-dependent morphological state of the growth plate. Significant variation in the chondrocytes morphology was observed within different histological zones. Maximum chondrocytes volume and surface area were found in the hypertrophic zone compared to the reserve and proliferative zones. Chondrocyte volume and surface area increased about five- and three-fold respectively as approaching the chondro-osseous junction from the pool of reserve cells. Chondrocytes from the proliferative zone were the most discoidal cells among three different histological zones. Significant differences were also observed in cell/matrix volume ratio between the three zones. Minimum and maximum cell/matrix volume ratios were identified in the reserve and proliferative zone, respectively.

Three-dimensional morphological tissue and cellular analyses under compression, based on Calcein AM loaded explants, serial sections and quantitative morphological evaluations, prior to loading and after relaxation indicated zone-dependent biomechanical behaviour. Greater chondrocyte bulk strains (volume decrease normalized to the initial cell volume) were found in the proliferative and hypertrophic zones, with lower chondrocyte bulk strains in the reserve zone. Following compression, the cell/matrix volume ratio decreased in the reserve and hypertrophic zones whereas it increased in the proliferative zone.

Tissue level biomechanical analyses, based on Syto-17 loaded explants, 2D imaging and digital image correlation (DIC), resulted in heterogenous and zone-dependent mechanical behaviour of growth plate. Higher axial strains arose in the proliferative zone compared to the two other histological zones. Moreover, higher transverse strains were mainly found in the proliferative and hypertrophic zones compared to the reserve zone. On the contrary, lower and more homogenous axial as well as transverse strains developed primarily within the reserve zone.

Biochemical analyses indicated that the reserve zone contains higher collagen content compared to the proliferative and hypertrophic zones. However, similar contents in water and GAG were obtained for all three histological zones.

Polarized microscopy investigation showed that fibers in the reserve zone were organized mainly horizontally (parallel to the growth plate/bone interface) in a radial fashion. However, some fibers were also observed as aligned in other directions in this zone. Collagen fibers were aligned almost exclusively vertically (parallel to the growth direction) in the proliferative and hypertrophic zones.

First of all, at the histomorphological level, the marked heterogeneity in cell size through the different histological zones of the growth plate observed in this study are consistent with previous studies on chondrocyte morphology using conventional histology and stereological methods. Chondrocytes undergo spatial shape changes while progressing from the reserve zone to the chondro-osseuse junction. Reserve and hypertrophic chondrocytes were round relative to the flattened proliferative chondrocytes. This was confirmed by the significantly lower sphericity values of proliferative chondrocytes, as compared to reserve and hypertrophic zones. Tissue and cellular morphology may have noteworthy contribution to the growth plate behavior during growth process.Thus, the ability to obtain in situ cell morphometry and monitor the changes in the growth direction could improve our understanding of the mechanisms through which abnormal growth is triggered.

Secondly, chondrocytes and their surrounding extracellular matrix undergo significant zonedependent morphological changes with compression, most probably due to heterogeneous mechanical properties characterizing the three zones, where the reserve zone was found stiffer along and perpendicular to the compression axis. In our study, hypertrophic chondrocytes showed the greatest deformations among chondrocytes of the three histological zones. Hence, hypertrophic chondrocytes could be more prone to trigger altered biological messages, potentially through cell membrane stretch, which is believed to modulate second messenger activity, and eventually cause growth deceleration under mechanical compression.

The growth plate collagen content and collagen fiber orientation were also non uniform through the growth plate thickness. Random dispersion of chondrocytes in the reserve zone and the columnar arrangement of chondrocytes in proliferative and hypertrophic zones correlate with the observed orientation of collagen fibers in these zones. Moreover, our data corroborates existing data on growth plate bio-composition.

Finally,the zone-dependent biomechanical behavior of the growth plate under compression is related to its collagen content and collagen fiber organization. Reserve zone, which was less susceptible to strains compared to proliferative and hypertophic zones, contained the maximum collagen content with fibers aligned perpendicular to growth direction. Conversely, lower collagen content and longitudinally oriented collagen fibers were detected in the proliferative and hypertrophic zones with high proneness to strains. Overall, the proliferative and hypertrophic zones, where lower collagen levels and longitudinally organized collagen fibers were found, could be more susceptible to compressive strains at both cellular and tissue levels. The more rigid reserve zone could play a more significant role of mechanical support compared to the proliferative and hypertrophic zones, which would be more likely to be involved in the process of growth modulation. These data add to our understanding of the relationship between compressive forces experienced by growth plate chondrocytes and their extracellular environment.

The main limits of this research project include the use of a single animal model without considering the variations with site and developmental stage, the limited sample size as well as limited statistical analyses for establishing relationships between mechanical behaviour and structural characteristics. In return, this study was the first to offer significant information on the growth plate mechanical behavior and morphological and structural characteristics as well as their relationships in an animal model with a lower growth rate that most resembles human.

The three hypotheses of this study, stating that:​ 1) different histomorphometrical characteristics are found within the three zones of growth plate, 2) cell deformation and strain distribution at tissue and cellular levels are non uniform within the three zones of the growth plate under uniform compressive stress, and 3) strain distribution is related to the biochemical composition of the extracellular matrix (GAG and collagen contents), the water content as well as type II collagen organization within the three zones of the growth plate, are therefore confirmed for 1) and 2) and partly confirmed for 3).

Overall, histological zones most actively involved in longitudinal bone growth (proliferative and hypertrophic) would be more susceptible to compressive strains both at cellular and tissue levels due to their histomorphological and structural characteristics, and hence more prone to be involved in the progression of infantile and juvenile musculoskeletal deformities. A combined improved knowledge of growth plate mechanics and mechanobiology is essential to better understand the possible mechanisms through which abnormal growth is triggered and to eventually improve the minimally invasive treatment approaches of progressive skeletal deformities, which directly exploit the process of growth modulation to correct these deformities.