This thesis aimed to develop engineered matrices supporting high survival of encapsulated neurons and fast neurite outgrowth, as well as the tools enabling control of the growth pattern in 3D. To this purpose, we designed a number of new hydrogels and two-photon patterning protocols.

We found that a dynamic phase separation triggered by cross-linking of synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels in the presence of some polysaccharides enabled to create interconnected porous structures, with tunable size ranging from submicron to dozens of microns. The resulting gels were simultaneously more permissive to invasion through the interconnected porous network, and more stable. The new protocols were shown to support an array of 3D neuronal cultures in vitro, as well as in vivo regeneration in a sciatic nerve injury model. This new method to control the macroporosity, which has the outstanding advantages of being compatible with injection and cell encapsulation, could be useful for a wide array of applications in hydrogelbased tissue engineering.

We then developed more biomimetic hydrogels based on hyaluronan as a polymer and using enzymatic reactions for cross-linking. In particular, the human coagulation factor XIII could be used to cross-link gels with good kinetics and biocompatibility, supporting neural network formation from encapsulated neurons. Later on, the bacterial ligase sortase A was shown to provide improved up-scalability and reagent stability, as well as even better kinetics, with the possibility to reach nearly instantaneous gelation, without sacrificing on cytocompatibility and biocompatibility. These enzymatic hydrogels could also have a wide scope of application, and we already demonstrated their use for cartilage tissue engineering. In particular, hydrogels encapsulating human chondroprogenitor cells, initially soft and brittle, reached a stiffness of the same order of magnitude as native hyaline cartilage after 3 weeks of culture.

Several of the defined gels developed or of the natural matrices classically used for neurons were also used in a systematic screening to identify a defined matrix supporting the growth of epithelial organoids (small intestine, liver and pancreas), traditionally grown in basal membrane extract from murine sarcoma. A fibrin/laminin minimal hydrogel was identified. These gels pave the way to a wide range of applications in high content screening and regenerative medicine.

Finally, we established a method making use of the enzymatic systems used/introduced earlier, to enable two-photon patterning of sensitive growth factors. Thanks to the improved orthogonality provided by the sortase A, the method works not only in inert gels such as alginate, but also in the common mammalian matrices collagen, hyaluronan, fibrin and laminin-rich basal membrane extract. This enabled us to demonstrate the guidance of encapsulated sensory neurons in 3D with patterns of nerve growth factor.

Overall, the new tools introduced give exceptional control over hydrogel properties, including their porosity, gelation kinetics, spatial patterning, as well as their cyto/biocompatibility and bioorthogonality. These tools have already advanced the possibilities in neural tissue engineering, as well as cartilage tissue engineering and organoid cultures, and we hope that they will find widespread further usage for neural applications as well as in applications to other tissues.

Cette thèse avait pour but de développer des matrices artificielles qui supportent l’encapsulation de neurones sans affecter leur viabilité et permettent une croissance rapide de neurites, ainsi que les outils pour contrôler et orienter leur croissance en 3D. Pour ce faire, nous avons conçu plusieurs nouveaux hydrogels et protocoles de structuration utilisant l’excitation à deux photons.

Nous avons découvert que la séparation de phase dynamique déclenchée par la réticulation de gels synthétiques en polyethylène glycol (PEG) en présence de certains polysaccharides permettait la création de structures poreuses interconnectées, avec une des pores de taille ajustable depuis la fraction de micromètre jusqu’aux douzaines de microns. Les gels obtenus sont simultanément plus permissifs à l’invasion cellulaire à travers le réseau poreux, et plus stables que leurs équivalents non-structurés. Nous avons ensuite montré que les ces gels macroporeux supportent de nombreuses cultures neuronales en 3D in vitro, ainsi que la régénération du nerf sciatique dans un modèle animal. Cette nouvelle méthode pour contrôler la macroporosité, qui a les avantages exceptionnels d’être compatible avec des injections ou l’encapsulation de cellules, pourrait être utile dans de nombreuses applications concernant l’ingénierie tissulaire à base d’hydrogels.

Nous avons ensuite développé des hydrogels davantage biomimétiques, basés sur le hyaluronane comme polymère et réticulés via des réactions enzymatiques. En particulier, le factor de coagulation XIII humain a été utilisé pour obtenir des gels réticulés avec une bonne cinétique et biocompatibilité, lesquels ont pu être utilisés pour former des réseaux de neurones actifs à partir de cellules dissociées et encapsulées. Nous avons ultérieurement montré que la ligase bactérienne sortase A était capable de donner d’encore meilleures propriétés en terme de de mise à l’échelle, de stabilité, et de cinétique, avec la possibilité d’atteindre une gélation presque instantanée, sans sacrifice en termes de biocompatibilité. Ces hydrogels enzymatiques pourraient trouver un large champ d’application, et nous avons déjà démontré leur usage pour l’ingénierie de cartilage. En particulier, après avoir encapsulé des cellules progénitrices de cartilage humain dans ces gels initialement mous et fragiles, nous avons constaté la formation de tissue avec une rigidité du même ordre de grandeur que le cartilage articulaire, après seulement trois semaines en culture.

Plusieurs de ces gels synthétiques ou naturels développés ou classiquement utilisés pour les cultures de neurones ont aussi été utilisés dans la recherche systématique d’un gel défini qui puisse supporter la croissance d’organoides épithéliaux (intestin grêle, foie et pancreas), autrement traditionnellement cultivés dans un extrait de membrane basale de sarcome de souris. Nous avons identifié un hydrogel minimal suffisant composé de fibrine et de laminine. Ces gels ouvrent la voie vers un large spectre d’applications en criblage pharmaceutique et en médecine régénérative.

Enfin, nous avons établi une méthode qui emploie les systèmes enzymatiques introduits précédemment pour permettre la déposition structurée via excitation à deux photons de facteurs de croissances sensibles. Grâce à la bio-orthogonalité supérieure conférée par la sortase A, cette méthode marche non seulement dans des gels inertes comme l’alginate, mais aussi dans les matrices extracellulaires communes chez les mammifères, comme le collagène, le hyaluronane, la fibrine, et l’extrait de lame basale riche en laminine. Ceci nous a permis de démontrer le guidage d’axones à partir de neurones sensoriels encapsulés en 3D, via des canaux de facteur de croissance nerveux.

Globalement, les nouveaux outils introduits donnent un contrôle exceptionnel des propriétés des hydrogels, en particulier leur porosité, temps de gélation, structuration dans l’espace, ainsi que leur biocompatibilité et leur orthogonalité aux systèmes biologiques. Nous avons déjà montré que ces outils pouvaient avancer le champ des possibles en ingénierie des tissus nerveux, ainsi que pour l’ingénierie de cartilage et pour les cultures d’organoides. Nous espérons qu’ils trouveront de nombreuses autres applications en ingénierie neuronale ou pour la régénération d’autres tissus.